與奧沙利鉑耐藥相關外泌體miR-208b促進CRC的Treg擴增

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-07-21
奧沙利鉑耐藥是結直腸癌(CRC)患者治療中的一個挑戰(zhàn)。調節(jié)性T細胞(Treg)以其免疫抑制作用而聞名,靶向Treg是提高化療敏感性......


奧沙利鉑耐藥是結直腸癌(CRC)患者治療中的一個挑戰(zhàn)。調節(jié)性T細胞(Treg)以其免疫抑制作用而聞名,靶向Treg是提高化療敏感性的有效途徑。Treg是一種提高化學敏感性的有效方法。外泌體遞送的miRNA被用作預測化療敏感性的潛在生物標志物。然而,Treg和外泌體miRNAs之間的關系仍然很大程度上是未知的。本研究結果表明,腫瘤分泌的miR-208b通過靶向PDCD4促進Treg擴增,這可能與CRC中奧沙利鉑化療敏感性的降低有關本。這些發(fā)現突出了外泌體miR-208b作為奧沙利鉑治療反應的預測生物標志物的潛在作用,并且它們是免疫治療的新靶點。本研究于2021年4月發(fā)表于《Molecular Therapy》IF: 8.986期刊上。

 

技術路線:

主要實驗結果:

1循環(huán)miR-208bCRCFOLFOX化療敏感性的一種很有前途的生物標志物

如圖1所示,作者設計了一項多期研究,以確定新的血清miRNAs作為預測和監(jiān)測奧沙利鉑聯合亞葉酸和5-FU(FOLFOX)化療反應的替代標志物。

1描述實驗設計的流程圖

 

作者檢測了69個化療敏感和47個化療不敏感患者的血漿中miR-208b表達,結果顯示與未響應組相比,miR-208b的表達水平在響應組顯著下調(圖2A-B)。同時檢測了血清癌胚抗原(CEA)水平,血清miR-208b的曲線下面積(AUC)與血清CEA的AUC相比,優(yōu)于血清CEA水平。在化療響應組,在化療前miR-208b的表達高于化療后,而在未響應組,化療前低于化療后水平(圖2C)。生存分析顯示,無進展生存期化療響應組顯著高于未響應組,miR-208b低表達組顯著高于高表達組(圖2D)。這些結果表明miR-208b可作為預測CRC中FOLFOX化療敏感性的非侵襲性標志物。

2循環(huán)miR-208bCRCFOLFOX化療敏感性的很有前途的生物標志物

 

2miR-208b由結腸癌細胞以外泌體的方式分泌

隨后,作者探究了miR-208b的存在方式是否由外泌體介導。分離鑒定了3株CRC細胞系的外泌體,并檢測了其中miR-208b的表達。外泌體中miR-208b的表達模式和在細胞中的模式一致,在SW480-OXA顯著高于SW480顯著高于NCM460。這些結果表明CRC中miR-208b的是以外泌體的模式分泌,這可能和順鉑化療敏感性有關。

3 miR-208b由結腸癌細胞以外泌體的方式分泌

 

3、SW480細胞分泌的外泌體miR-208b促進Treg擴增

前人研究表明順鉑會影響腫瘤免疫微環(huán)境。MiRNA可能通過促進Treg擴增誘導免疫侵襲。因此,作者探究了CRC分泌外泌體miR-208b對T細胞分化的影響。使用siRNA去除miR-208b,然后收集外泌體,將含有不同水平miR-208b的外泌體與原代CD4+ T細胞共培養(yǎng)(圖4A-B)。6h后,受體CD4+ T細胞中miR-208b顯著增加,尤其是SW480-OXA組,而外泌體miR-208b缺失組則沒有顯著改變,表明CD4+ T細胞中miR-208b是由外泌體傳輸(圖4C-D)。此外,SW480和SW480-OXA來源外泌體處理組的CD4+CD25highFoxp3+ Tregs細胞數顯著增加,而外泌體miR-208b缺失對其陽性細胞數則沒有明顯影響。表明外泌體miR-208b促進Treg擴增。

4 SW480細胞分泌的外泌體miR-208b促進Treg擴增

 

4miR-208b直接靶向和抑制CD4+ T 細胞中PDCD4的表達

為了進一步探究miR-208b的分子機制,探究了其下游靶基因機制,使用生信預測了其靶基因,最終挑選到PDCD4(圖5A)。熒光素酶進一步證實了miR-208b和PDCD4之間的結合(圖5C-D)。研究發(fā)現,T細胞中PDCD4的表達在SW480外泌體處理組顯著下降,而這個抑制作用在SW480-OXA組更加明顯,PCD表達在miR-208b缺失組則顯著升高(圖5E)。此外,加入miR-208b mimics后,PDCD4蛋白顯著降低,而抑制miR-208b后,PDCD4蛋白的表達相對增強,此外,PDCD4在mRNA水平的表達沒有明顯變化(圖5F)。然后,評估了miR-208b對CD4+ T細胞擴增的影響。研究表明,轉染miR-208b mimics顯著增強了Treg的擴增,而抑制miR-208b水平則抑制了Treg的擴增(圖5G-H)。這些結果表明miR-208b直接靶向抑制PDCD4的表達,導致Treg分化。

5 miR-208b通過直接靶向和抑制PDCD4的表達來促進Treg的擴增

 

5確認PDCD4在調節(jié)Treg擴增中的作用

隨后探究了PDCD4在調節(jié)Treg擴增中的作用。如圖A-C所示,成功構建了PDCD4的過表達和干擾表達細胞系。與對照組相比,PDCD4過表達顯著降低了Treg細胞的擴增率,而干擾其表達則顯著提高了Treg細胞的擴增率。表明PDCD4是負調節(jié)Treg細胞擴增的關鍵基因。

6 PDCD4Treg擴增密切相關

 

6腫瘤來源外泌體miR-208b影響體內化療效果和腫瘤生長

隨后作者探究了腫瘤來源外泌體miR-208b體內對化療效果和腫瘤生長的影響。用慢病毒轉染CT26細胞產生miR-208b過表達和miR-208b敲低細胞系。動物實驗設計示意圖如圖7A所示,實驗采用6組(每組10只小鼠),其中3組使用奧沙利鉑,BALB/c小鼠植入CT26細胞,建立腫瘤植入模型。如圖7B-7D所示,miR-208b-OE組腫瘤生長速度較快,而中miR-208-KD組腫瘤生長明顯慢于對照組。

從各組小鼠中分離出外周血CD4+ T細胞,結果顯示miR-208b-OE組中PDCD4的顯著下調,miR-208-KD組的結果則相反(圖7E和7F)。然而,在PDCD4 mRNA水平上沒有觀察到差異(圖7G)。從血清中分離出外泌體,檢測miR-208b水平(圖7H)。如預期的,miR-208b在miR-208b-OE組中顯著升高,而miR-208b-KD組中miR-208b水平下降 (圖7I)。這些結果表明,腫瘤分泌的miR-208b在體內可以充分地傳遞到CD4+ T細胞中,抑制PDCD4的表達。此外,這種現象在奧沙利鉑治療組更加顯著(miR-208b-OE + OXA和miR-208b-KD+ OXA)。

7 miR-208b通過促進Treg在體內的擴增來促進腫瘤生長

 

接下來,測定了分泌的miR-208b對體內Treg和存活的影響,如圖8A-B所示,CD4+- CD25+ Foxp3+ Treg在外周血和脾臟分離的總CD4+ T細胞群中的比例在miR-208b-OE組和miR-208b-OE + OXA組顯著升高,而在miR-208b-KD和miR-208b-KD + OXA顯著下降。與此一致,miR-208b低表達組的生存率也顯著高于高表達組(圖8C)。綜上所述,這些結果表明,腫瘤分泌的miR208b增加了Treg的百分比,促進了腫瘤在體內的生長。此外,奧沙利鉑在體內可以通過miR-208b調控Tregs的數量,這與奧沙利鉑成分的化學敏感性有關。

8癌細胞分泌的miR-208b增加了體內Treg的數量


參考文獻:

Ning et al., Exosomal miR-208b related with oxaliplatin resistance promotes Treg expansion in colorectal cancer, Molecular Therapy (2021), https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.04.028