METTL3通過m6A修飾抑制APC表達(dá)促進(jìn)食管癌進(jìn)展

食道癌是世界上第六大最常見的腫瘤，據(jù)報(bào)道患者5年生存率只有12-20%。N 6 -甲基腺苷 (m6A) 修飾是真核生物 mRNA 中最豐富的 RNA 修飾，主要由 m 6 A 調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)。m 6 A 修飾調(diào)節(jié) RNA 穩(wěn)定性和翻譯效率、染色質(zhì)狀態(tài)、替代聚腺苷酸化和前體 mRNA 剪接。

今天我們來講一篇刊登在Nature Communications（IF=14.91）上的一篇文章，題名為METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N 6-methyladenosine-dependent YTHDF binding。

上調(diào) METTL3 與 ESCC 患者的不良生存相關(guān)

為探討食管癌中中METTL3的表達(dá)譜，分析了腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與11個(gè)相鄰的正常食管上皮組織相比，95個(gè)食管癌標(biāo)本中METTL3的表達(dá)顯著上調(diào)。對(duì)包含81對(duì)ESCC標(biāo)本和鄰近正常食管上皮組織的組織芯片進(jìn)行IHC染色顯示，ESCC組織中的METTL3表達(dá)水平顯著高于配對(duì)鄰近正常組織。Kaplan-Meier分析顯示，高表達(dá)METTL3的患者總生存時(shí)間比低表達(dá)METTL3的患者短。9種不同ESCC細(xì)胞系中METTL3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平高于Het-1a永生化正常食管上皮細(xì)胞。這些結(jié)果表明，METTL3在食管鱗癌中表達(dá)上調(diào)，并與食管鱗癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

METTL3促進(jìn)小鼠ESCC細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)

為了確定METTL3在細(xì)胞增殖中的作用，通過轉(zhuǎn)染METTL3 shRNAs來去除ESCC細(xì)胞中的METTL3。發(fā)現(xiàn)METTL3缺失減少了這些細(xì)胞的增殖和集落數(shù)。通過在KYSE180和KYSE450中重組表達(dá)METTL3，這些抑制作用被消除。

   接下來在KYSE450細(xì)胞中建立四環(huán)素誘導(dǎo)的METTL3表達(dá)。四環(huán)素治療以劑量依賴的方式增加METTL3的表達(dá)，相應(yīng)地引起細(xì)胞增殖水平的增加和集落形成水平的增加。與野生型（WT）METTL3的過表達(dá)相比，在ESCC細(xì)胞中METTL3非活性突變體的過表達(dá)未能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。這些結(jié)果有力地表明，METTL3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖依賴于其表達(dá)水平和完整的活性。

為了確定METTL3在小鼠腫瘤生長(zhǎng)中的作用，將KYSE180或KYSE450細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)METTL3缺失降低了腫瘤大小、體積和重量。與表達(dá)METTL3非活性突變體引起的有限效應(yīng)相比，WT METTL3過表達(dá)極大地促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明METTL3的表達(dá)有助于小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。

METTL3 介導(dǎo) APC mRNA 上的 m6A 上調(diào)

為了確定METTL3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，檢測(cè)了METTL3在ESCC細(xì)胞上轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用。METTL3缺失降低了KYSE180細(xì)胞中m6A的總豐度。甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）和m6A特異性抗體，然后進(jìn)行RNA測(cè)序（MeRIP-seq），發(fā)現(xiàn)KYSE180的mRNA中鑒定的m6A位點(diǎn)與RRACH序列一致。m6A信號(hào)在mRNAs的終止密碼子和3′-非翻譯區(qū)富集。

在MeRIP-seq中METTL3缺失減少了1101個(gè)基因的mRNAs中1199個(gè)m6A峰。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)METTL3缺失調(diào)節(jié)2973個(gè)基因的表達(dá)。二者取交集發(fā)現(xiàn)共有93個(gè)基因重疊。MeRIP-seq中細(xì)胞成分（CC）項(xiàng)的基因本體（GO）富集分析表明，在METTL3缺失的KYSE180細(xì)胞中，β-連環(huán)蛋白降解復(fù)合物（的基因組（包括APC）中m6A水平顯著降低。

APC是促進(jìn)β-連環(huán)蛋白降解調(diào)節(jié)因子。m6A峰位于APC末端密碼子區(qū)域附近的最后一個(gè)外顯子，METTL3缺失降低了APC mRNA的m6A水平。分析顯示，有三個(gè)腺苷堿基甲基化，并且在METTL3缺失導(dǎo)致的APC mRNA m6A峰值下降范圍內(nèi)。這些結(jié)果表明METTL3調(diào)節(jié)apcmrna的m6A水平，這種水平在許多類型的癌細(xì)胞中都很高。

m6A-RIP和實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，在KYSE180細(xì)胞中，METTL3缺失后，APC mRNA中的m6A水平顯著降低。相反，METTL3過表達(dá)增加了KYSE180細(xì)胞中APC mRNA的m6A水平，并且這種增加被METTL14缺失所消除。此外，帶有抗METTL3的RIP顯示METTL3與KYSE180和KYSE450細(xì)胞中的APC mRNA結(jié)合。這些結(jié)果表明METTL3與apcmrna結(jié)合并以METTL14依賴的方式增強(qiáng)其m6A水平。

APC mRNA 上的 METTL3 依賴性 m6A 上調(diào)抑制 APC 表達(dá)

為了確定METTL3依賴的m6A調(diào)控對(duì)APC表達(dá)的影響，構(gòu)建了一個(gè)熒光素酶報(bào)告基因，熒光素酶分析顯示，METTL3缺失大大增加了WT APC的熒光素酶活性，而突變的APC提高了熒光素酶活性并使該活性抵抗METTL3缺失的調(diào)節(jié)。相反，METTL3過表達(dá)抑制了WT-APC的熒光素酶活性，但沒有突變的APC。這些結(jié)果表明METTL3介導(dǎo)的m6A水平的APC mRNA上調(diào)抑制了APC的表達(dá)。

與這一發(fā)現(xiàn)一致，METTL3缺失增加了APC mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)（，并且這些增加被KYSE450細(xì)胞中rMETTL3的重組表達(dá)所消除。此外，METTL3的過表達(dá)降低了KYSE450細(xì)胞中APC的表達(dá)，四環(huán)素劑量依賴性增加的METTL3表達(dá)水平與APC水平呈負(fù)相關(guān)。相反，METTL3非活性突變體與WT對(duì)應(yīng)物不同，未能調(diào)節(jié)APC表達(dá)。值得注意的是，ESCC細(xì)胞中的METTL14缺失消除了METTL3的過度表達(dá)降低了APC的表達(dá)。這些結(jié)果表明，在ESCC細(xì)胞中，METTL3與METTL14共同介導(dǎo)的APC mRNA m6A上調(diào)抑制了APC mRNA和蛋白的表達(dá)。

METTL3 增強(qiáng) APC mRNA 的 m6A 和隨后的 YTHDF 結(jié)合抑制 APC 表達(dá)

YTHDF1-3介導(dǎo)mRNA降解，針對(duì)YTHDF1的抗體進(jìn)行RIP分析，實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，在KYSE180中，與APC mRNA結(jié)合的YTHDF2的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于YTHDF1和YTHDF3的數(shù)量，并且由于METTL3缺失而減少。這些結(jié)果表明METTL3增加了APC mRNA的m6A，在很大程度上促進(jìn)了YTHDF2與APC mRNA的結(jié)合。

為了研究YTHDF2與APC mRNA結(jié)合在APC表達(dá)中的作用，我們?nèi)コ?/span>YTHDF2，這增加了KYSE450細(xì)胞中APC的mRNA（圖5d和補(bǔ)充圖5e）和蛋白質(zhì)表達(dá)。YTHDF1–3的聯(lián)合缺失進(jìn)一步增加了這些細(xì)胞中APC的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，還進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告子分析，結(jié)果表明，缺失YTHDF2增強(qiáng)了由含m6A的WT APC CDS序列驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性，而突變的APC增強(qiáng)了熒光素酶活性，并使該活性抵抗了YTHDF2缺失的調(diào)節(jié)。此外，METTL3過表達(dá)抑制由WT APC CDS序列驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性通過YTHDF2耗竭恢復(fù)，其不影響突變的APC增強(qiáng)的熒光素酶活性。這些結(jié)果表明METTL3增加了APC mRNA的m6A，隨后的YTHDF結(jié)合抑制了APC的表達(dá)。

METTL3降低APC表達(dá)，促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的下游基因表達(dá)、有氧糖酵解、ESCC細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展

APC功能的喪失使β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定，從而誘導(dǎo)下游基因（CCND1和MYC）的表達(dá)。CCND1促進(jìn)細(xì)胞周期，c-Myc增強(qiáng)有氧糖酵解。正如預(yù)期的那樣，METTL3缺失增強(qiáng)了KYSE180細(xì)胞中APC的表達(dá)，降低了β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞CCND1、c-Myc和PKM2的表達(dá)。此外，METTL3缺失降低了葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞集落數(shù)。值得注意的是，這種METTL3缺失引起基因表達(dá)（圖6a）、糖酵解（圖6b，c）、細(xì)胞增殖（補(bǔ)充圖6f）和集落形成的抑制在很大程度上被這些細(xì)胞中的APC缺失所消除。相反，METTL3過度表達(dá)引起葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的增加，這被YTHDF2消耗所消除。這些結(jié)果表明METTL3降低APC表達(dá)，促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的下游基因表達(dá)、有氧糖酵解和ESCC細(xì)胞增殖。

為了確定METTL3誘導(dǎo)的APC表達(dá)下調(diào)在小鼠腫瘤生長(zhǎng)中的作用，將KYSE180細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)通過APC去除，METTL3去除使腫瘤大小、體積和重量減小，并且腫瘤組織中的乳酸量恢復(fù)。此外，IHC染色顯示，METTL3缺失增加AP的表達(dá)，相應(yīng)地減少了腫瘤組織中β-連環(huán)蛋白、cyclind1、c-Myc和PKM2的表達(dá)。這些結(jié)果表明METTL3抑制APC的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

APC表達(dá)下調(diào)與食管鱗癌標(biāo)本METTL3上調(diào)及食管鱗癌患者預(yù)后不良相關(guān)

為了確定METTL3抑制APC表達(dá)的臨床相關(guān)性，分析TCGA數(shù)據(jù)， APC mRNA表達(dá)與ESCC中METTL3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，ESCC標(biāo)本中APC的表達(dá)顯著下調(diào)。81例ESCC標(biāo)本的IHC染色觀察到METTL3蛋白表達(dá)與APC蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，METTL3蛋白表達(dá)與β-連環(huán)蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。此外，APC的高表達(dá)與ESCC患者的長(zhǎng)期總生存時(shí)間顯著相關(guān)。這些結(jié)果提示APC表達(dá)下調(diào)與METTL3表達(dá)上調(diào)及ESCC患者預(yù)后不良相關(guān)。