SUMOylation促進細胞外囊泡介導的lncRNA ELNAT1的傳遞和膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
小泛素修飾(SUMO)結(jié)合稱為SUMO修飾，其作為生物活性分類的誘導劑分子進入細胞外囊泡(EVs)，觸發(fā)淋巴管生成，進一步驅(qū)動腫瘤淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移，但確切的機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，SUMOylation促進細胞外囊泡介導的lncRNA ELNAT1的傳遞和膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。該文于2021年4月發(fā)表在《The Journal of Clinical Investigation》IF: 14.808。
技術路線：
結(jié)果：
1. SUMOylation參與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
為了探討SUMOylation在膀胱癌（BCa）的淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移中的作用，作者基于淋巴癌與TCGA數(shù)據(jù)庫中比較SUMOylation的表達譜，發(fā)現(xiàn)BCas中UBC9的高表達，同時生成分析顯示，與UBC9表達較低的患者相比，UBC9表達較高的患者總生存率（OS）和無病生存期（DFS）較低（Figure 1 A-E）。為了證明UBC9在LN轉(zhuǎn)移中的作用，作者通過242例的BCas患者樣本，發(fā)現(xiàn)UBC9在LN轉(zhuǎn)移過程中高表達（Figure 1 F）。接下來為了證明，SUMOylation對BCas誘導的淋巴內(nèi)皮管的形成和遷移作用，通過其特異性抑制劑阻斷SUMOylation （2D-08）明顯抑制了該誘導過程（Figure 1 G-I）。以上數(shù)據(jù)表明，UBC9異常高表達與膀胱癌進展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關，SUMOylation參與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
Figure 1 SUMOylation參與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
2. EVs介導的ELNAT1過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關
EVs介導的lncRNA轉(zhuǎn)運是腫瘤細胞與TME之間通過信號轉(zhuǎn)導發(fā)生的一個關鍵過程。作者采集各5例的健康志愿者與BCas患者的尿液，通過NGS測序確定了EVs中lncRNA的整體表達譜，結(jié)合與SUMOylation途徑的相關性，最終篩選出EVs中異常高表達的lncRNA ELNAT1（Figure 2 A, B）。結(jié)合BCa與LN轉(zhuǎn)移，ELNAT1在BCa與LN轉(zhuǎn)移中高表達（Figure 2 C, D），并且ELNAT1過表達與BCa患者預后不良相關（Figure 2 E, F）。另外，在瘤內(nèi)和瘤旁區(qū)域ELNAT1的表達與淋巴管密度正相關（Figure 2 G, H），提示ELNAT1廣泛參與BCa的淋巴管生成。
為了證明ELNAT1與BCa分泌的EV的關系，作者從BCa細胞培養(yǎng)基中分離出EVs，采用透射電子顯微鏡(TEM)、納米粒子跟蹤分析(NTA)及對EVs的蛋白標志物檢測，證明了作者準確分離出BCa分泌的EV（Figure 2 J-L）。并且從BCa患者和健康志愿者尿液樣本中分離的EVs中檢測ELNAT1的表達，發(fā)現(xiàn)ELNAT1在BCa分泌的EV中過表達（Figure 2 I）。以上數(shù)據(jù)表明，EVs介導的ELNAT1過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。
Figure 2 EVs介導的ELNAT1過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關
3. EVs介導的ELNAT1促進BCa體內(nèi)外淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移
為了確定EV介導的ELNAT1是否促進體外淋巴管生成，作者用HLECs孵育BCa細胞分泌的EVs的檢測管形成和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，干擾ELNAT1基因會破壞UM-UC-3和T24細胞分泌EVs誘導HLECs管形成和遷移的能力（Figure 3 A-C），這些結(jié)果表明EVs介導的ELNAT1誘導了體外淋巴管生成。
為了確定EVs介導的ELNAT1在體內(nèi)促進LN轉(zhuǎn)移，首先構(gòu)建一個小鼠腘窩的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。小鼠隨機分為2組（n = 12），每3天接受由載體（UM-UC-EV Vector）或ELNAT1（UM-UC-3-EV ELNAT1）轉(zhuǎn)染的UM-UC-3細胞分泌的EVs 瘤內(nèi)注射，當原發(fā)腫瘤大小達到200mm3時采集腫瘤和腘窩的LNs（Figure 3D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）發(fā)現(xiàn)，與UM-UC-EV Vector相比，UM-UC-3-EV ELNAT1促進了UM-UC-3細胞向腘窩LNs的轉(zhuǎn)移，LNs體積更大（Figure 3 E- I）。
由于淋巴管生成是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關鍵步驟，因此進一步評估了EVs介導的ELNAT1在體內(nèi)對淋巴管生成的影響。結(jié)果顯示，UM-UC-3-EV ELNAT1組顯著增加了小鼠足底腫瘤瘤內(nèi)和瘤旁區(qū)域的淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1陽性（LYVE-1 positive）（Figure 3 J, K）。以上結(jié)果表明，EVs介導的ELNAT1促進BCa體內(nèi)淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
Figure 3 EVs介導的ELNAT1促進BCa體內(nèi)外淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移
4. ELNAT1直接與hnRNPA1相互作用
由于lncRNA的分子功能與其亞細胞定位相關，通過FISH和亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)ELNAT1在UM-UC-3 和T24 細胞的細胞質(zhì)和細胞核均有表達（Supplemental Figure7 A, B）。并且通過RNA-pull down實驗，發(fā)現(xiàn)在分子量35~40 kDa上有明顯的條帶（Figure 4 A）。對此，通過質(zhì)譜（MS）和Western blot分析顯示，hnRNPA1是最豐富的ELNAT1相互作用蛋白（Figure 4 B-D）。熒光染色和RNA免疫沉淀（RIP）證實了ELNAT1和hnRNPA1在UM-UC-3和T24細胞中的共定位，并且ELNAT1通過內(nèi)源性hnRNPA1富集（Figure 4 E, F），進一步驗證了ELNAT1和hnRNPA1之間的相互作用。
此外，為進一步驗證ELNAT1與hnRNPA1相互作用區(qū)域，使用ELNAT1不同序列缺失進行RNA-pull down分析，以評估ELNAT1和hnRNPA1結(jié)合所需的區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELNAT1序列中600-750 nt位置是其與hnRNPA1交互作用區(qū)域（Figure 4 G, H）。并通過POSTAR2預測ELNAT1在610-680 nt區(qū)域的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能被hnRNPA1識別（Figure 4 I），而當這一區(qū)域缺失時，hnRNPA1減弱對ELNAT1的富集（Figure 4 J）。因此，這表明這些特定的序列（610-680 nt）對ELNAT1 hnRNPA1的相互作用至關重要。
5. ELNAT1與UBC9啟動子形成DNA-RNA三聯(lián)體，通過招募hnRNPA1增強H3K4me3修飾
為了探索ELNAT1誘導BCa淋巴轉(zhuǎn)移的分子機制，我們使用NGS檢測過表達ELNAT1的BCa細胞和對照細胞（Figure 5 A），由于SUMOylation已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)特異性RNA的識別，并參與RNA分選進入EVs的過程，因此鑒定ELNAT1的SUMOylation相關靶基因。在受ELNAT1調(diào)控的925個基因中，作者發(fā)現(xiàn)UBC9是SUMOylation相關基因變化最顯著的（Figure 5 B-D）。接著通過RNA純化（ChIRP）檢驗ELNAT1與UBC9中P1（153 ~ 143 bp）啟動子區(qū)域存在生理相互作用（Figure 5 E, F）。CD光譜證實ELNAT1/UBC9 TTS1組在270 ~ 280 nm處有一個顯著的正峰，在210 nm處有一個負峰。在FENDRR/PITX2陽性對照組中也有類似的發(fā)現(xiàn)（Figure 5 G, H）。FRET技術分析顯示, 與ELNAT1 / UBC9 TTS1組相比，熒光強度發(fā)生了巨大的變化：從520 nm到570–580 nm,熒光強度控制單鏈RNA / UBC9 ssRNA / UBC9 TTS1集團,這與FENDRR / PITX2陽性對照組類似（Figure 5 I, J）。
此外，ChIP分析顯示，過表達ELNAT1增加了hnRNPA1和組蛋白甲基化（H3K4me3）在UBC9啟動子上的富集，而通過刪除hnRNPA1的ELNAT1結(jié)合位點則抑制了富集（Figure 5 K, L）。同時，ELNAT1沉默顯著降低了UM-UC-3和T24細胞UBC9啟動子的hnRNPA1占用率和H3K4me3甲基化（Figure 5 M, N），這證明了hnRNPA1通過調(diào)節(jié)UBC9啟動子上的組蛋白甲基化，促進ELNAT1誘導UBC9的轉(zhuǎn)錄激活。以上結(jié)果說明，ELNAT1與UBC9啟動子形成DNA-RNA三聯(lián)體，通過招募hnRNPA1增強H3K4me3修飾。
Figure 5 ELNAT1與UBC9啟動子形成DNA-RNA三聯(lián)體，通過招募hnRNPA1增強H3K4me3修飾
6. ELNAT1通過UBC9誘導的hnRNPA1的SUMOylation被封裝到EVs中
UBC9可以催化靶蛋白的SUMOylation來調(diào)節(jié)它們與生物分子的相互作用和細胞運輸。Figure 6 A顯示，通過co-IP分析，觀察到一個明顯的15~25 kDa條帶被hnRNPA1特異性富集。此外，IP分析顯示UBC9過表達增強了hnRNPA1的SUMO2連接，表明UBC9誘導hnRNPA1的SUMOylation（Figure 6 B）。將hnRNPA1中SUMOylation修飾的位點賴氨酸3 （K3）和賴氨酸113 （K113）用精氨酸替代（Figure 6 C），并通過co-IP分析表明，證明了hnRNPA1中SUMOylation修飾的位點是K113（Figure 6 D）。ELNAT1過表達上調(diào)了hnRNPA1K113的SUMO化，而敲除UBC9則消除了這個影響（Figure 6 E）。
另外，之前報道過hnRNPA1將miR-196a和miR-320加載到EVs中，本研究ELNAT1表現(xiàn)出的EVs-細胞比率與miR-196a和miR-320相當（Figure 6 F）。hnRNPA1沉默顯著抑制了ELNAT1在BCa細胞分泌的EVs中的富集（Figure 6 G）。此外，缺失的ELNAT1（包含hnRNPA1結(jié)合位點的610-680 nt）主要保留在BCa細胞中（Figure 6 H），證實了ELNAT1通過與hnRNPA1的相互作用被加載到EVs中。
驗證SUMOylation是否有助于hnRNPA1介導的EVs包裹ELNAT1。在BCa細胞中，hnRNPA1中K113位點突變使BCa細胞分泌的EVs中ELNAT1表達降低，沉默UBC9降低了BCa細胞分泌的EVs中ELNAT1的富集（Figure 6 I, J）。與hnRNPA1 WT沉默相比，hnRNPA1沉默后，轉(zhuǎn)染hnRNPA1K113R并不能恢復EVs介導的ELNAT1下調(diào)（Figure 6 K）。共聚焦顯微鏡顯示，在UBC9沉默或hnRNPA1K113R突變后，ELNAT1在CD36標志的多囊泡（MVBs）中的積累明顯下降（Figure 6 L），表明ELNAT1進入EVs受hnRNPA1的SUMO化調(diào)控。
Figure 6 ELNAT1通過UBC9誘導的hnRNPA1的SUMOylation被封裝到EVs中
7. EVs介導的ELNAT1被HLECs內(nèi)化以誘導淋巴管生成
共聚焦顯微鏡顯示HLECs中PKH67標記EVs孵育后的點狀熒光強度（Figure 7 A），表明HLECs內(nèi)化了BCa分泌的EVs。此外,孵化UM-UC-3-EVELNAT1顯著上調(diào)HLECs中ELNAT1表達,而孵化T24-EVsi-ELNAT1，則T24細胞分泌的EVs中ELNAT1表達下調(diào)，則削弱了HLECs中EVs誘導ELNAT1過表達的能力（Figure 7 B, C）。
為了排除淋巴血管生成是由內(nèi)源性ELNAT1激活HLECs中誘導的可能性，構(gòu)建了ELNAT1-KO HLECS ELNAT1（HLECsELNAT1-KO）模型（Figure 7 D, E）。與HLECsELNAT1-WT一致，我們觀察到，EVs介導的ELNAT1過表達增強了HLECsELNAT1-KO的管狀形成和遷移能力，而下調(diào)ELNAT1則抑制了BCa細胞分泌EVs誘導HLECsELNAT1-KO管狀形成和遷移的能力（Figure 7 F-H）。這表明BCa細胞分泌的EVs通過運輸EVs介導的ELNAT1促進淋巴管生成，而不是轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性的ELNAT1。綜上所述，這些結(jié)果表明EVs介導的ELNAT1被HLECs內(nèi)化誘導BCa淋巴管生成。
Figure 7 EVs介導的ELNAT1被HLECs內(nèi)化以誘導淋巴管生成
8. EVs介導的ELNAT1上調(diào)HLECs中SOX18的表達
qRT-PCR分析UM-UC-3-EV1載體或UM-UC-3-EVELNAT1處理的HLECs中淋巴管生成相關基因的表達，結(jié)果顯示SRY-box轉(zhuǎn)錄因子18 （SOX18）是最明顯的與EVs介導的ELNAT1表達正相關的基因（Figure 8 A, B）。此外，ChIRP分析表明EVs介導的ELNAT1與HLECs中SOX18啟動子的771~786 bp（p4）直接相互作用（Figure 8 C, D）。SOX18-p4區(qū)域的突變降低了EVs介導的ELNAT1誘導的熒光素酶活性（Figure 8 E, F），表明SOX18-p4對于EVs介導的ELNAT1誘導HLECs中SOX18的上調(diào)至關重要。hnRNPA1和H3K4me3在SOX18啟動子上的富集與EVs介導的ELNAT1表達顯著相關（Figure 8 G, J）。EVs介導的ELNAT1過表達增強了HLECs的管形成和遷移能力，而干擾SOX18則HLECs的管形成和遷移能力受損（Figure 8 K, M），表明SOX18是EVs介導的ELNAT1驅(qū)動體外BCa淋巴管生成所必需的。綜上所述，這些結(jié)果表明，EVs介導的ELNAT1通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)HLECs中SOX18的表達來促進BCa淋巴管生成。
Figure 8 EVs介導的ELNAT1上調(diào)HLECs中SOX18的表達
9. 阻斷SUMOylation抑制EVs介導的ELNAT1誘導的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
用si-NC或si-UBC9#1轉(zhuǎn)染的對照或ELNAT1過表達UM-UC-3細胞分泌的EVs處理HLECs，結(jié)果顯示過表達ELNAT1顯著促進了體外BCa細胞分泌的EVs誘導淋巴血管生成，而沉默UBC9逆轉(zhuǎn)了這一作用（Figure 9 A-C）。IVIS證明UM-UC-3-EVELNAT1增強了體內(nèi)腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而沉默UBC9抑制了這種作用（Figure 9 D, E）。UM-UC-3-EVELNAT1+ siUBC9 #1組的腘窩LNs體積比UM-UC-3-EVELNAT1組?。?/span>Figure 9 F）。與UM-UC-3-EVVector組相比，UM-UC-3-EVELNAT1增加了小鼠足底腫瘤的淋巴管數(shù)量，而下調(diào)UBC9的表達導致EVs介導的ELNAT1誘導的淋巴管數(shù)量逐漸減少（Figure 9 G, H）。此外， UM-UC-3-EVELNAT1+si-UBC9#1組的LN生成時間長于UM-UC-3-EVELNAT1組（Figure 9 I）。綜上所述，這些結(jié)果表明UBC9誘導的SUMOylation抑制EVs介導的ELNAT1誘導的BCa淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移。
Figure 9阻斷SUMOylation抑制EVs介導的ELNAT1誘導的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移
10. EVs介導的ELNAT1與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關
確定EVs介導的ELNAT1在BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的臨床意義十分重要。首先，作者發(fā)現(xiàn)來自BCa患者的尿中EVs與配對BCa組織的ELNAT1表達呈正相關，這意味著EVs介導的ELNAT1是BCa中ELNAT1調(diào)控的重要參與者（Figure 10 A）。同時，BCa患者的尿中EV介導的ELNAT1過表達與BCa的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關（Figure 10 B）。EV介導的ELNAT1表達較高的BCa患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）率較短（Figure 10 C-D）。ROC分析顯示尿液中EV介導的ELNAT1可有效區(qū)分BCa患者與健康志愿者 （Figure 10 E）。與尿液細胞學和FISH檢查結(jié)果相比，尿液中EVs介導的ELNAT1診斷BCa-LN轉(zhuǎn)移的準確性很高（Figure 10 F）。BCa患者血清中EVs介導的ELNAT1表達水平高于健康對照組（Figure 10 G）。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BCa患者血清相比，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BCa患者血清中EVs介導的ELNAT1表達上調(diào)（Figure 10 H）。
Figure 10 EVs介導的ELNAT1與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關
結(jié)論：EVs介導的ELNAT1促進了BCa的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。充分闡明EVs介導的ELNAT1激活hnRNPA1/UBC9/ SOX18軸誘導BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的精確機制，不僅將增加我們對EVs介導的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的認識，也將有助于開發(fā)一種治療BCa的有效策略。