m6A RNA甲基化是mRNA轉(zhuǎn)錄后最常見(jiàn)的內(nèi)部甲基化。這是一個(gè)由m6A WER系統(tǒng)控制的可逆過(guò)程,由書(shū)寫器(W)、擦除器(E)和閱讀器(R)組成,而m6A甲基化的最終結(jié)果取決于特異性閱讀器的識(shí)別并結(jié)合。目前研究發(fā)現(xiàn)抑制肺腺癌(LUAD)與m6A閱讀器YTHDC2相關(guān)。該研究2021年1月發(fā)表在《Redox biology》,IF:11.799的期刊上。
技術(shù)路線:
1. YTHDC2表達(dá)在LUAD中被抑制,且與臨床預(yù)后差相關(guān)
為了驗(yàn)證m6A閱讀器在肺癌的表達(dá),作者通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了LUAD中已知的閱讀器,包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1和IGF2BP1/2。如圖1A和B顯示,與正常肺相比,LUAD 中YTHDC2、IGF2BP2表達(dá)下調(diào),而結(jié)合Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier圖譜進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)較低的YTHDC2與LUAD患者較差的總生存率相關(guān)(圖1D),這證實(shí)了YTHDC2與LUAD存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系。
接著作者為了進(jìn)一步證明YTHDC2與LUAD的關(guān)系,與相鄰的癌旁組織相比,在LUAD腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA和蛋白的顯著下調(diào)(圖1E-G),組織芯片檢測(cè)(TMA)評(píng)估cohort #1中YTHDC2的表達(dá),結(jié)果顯示51% (98/192) LUAD患者的YTHDC2表達(dá)下調(diào)(圖1H、I)。值得注意的是,YTHDC2表達(dá)下調(diào)與更大的腫瘤直徑和更晚期的分期相關(guān)(圖1J、K)。表明抑制YTHDC2可促進(jìn)LUAD的腫瘤進(jìn)展。
圖1 YTHDC2表達(dá)在LUAD中被抑制,且與臨床預(yù)后差相關(guān)
2. 過(guò)表達(dá)YTHDC2抑制細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生
為了探索YTHDC2在體內(nèi)的m6A解讀器功能,作者構(gòu)建AAV5表達(dá)系統(tǒng)(KPYWT、KPYΔYTH和對(duì)照KPE)(圖2A)。與KPE小鼠感染25周后的腫瘤相比,KPYWT和KPYΔYTH小鼠的腫瘤證實(shí)了YTHDC2持續(xù)上調(diào)(圖2B),這表明AAV5表達(dá)系統(tǒng)具有持久的效率。雖然YTHDC2不能阻止腫瘤的發(fā)生,但腫瘤發(fā)生時(shí)間延遲,腫瘤負(fù)荷明顯受到抑制,KPYWT小鼠的生存時(shí)間比KPE小鼠和KPYΔYTH小鼠更長(zhǎng)(圖2C-F)。
作者進(jìn)一步研究YTHDC2是否是存在人類LUAD細(xì)胞中的一種腫瘤抑制因子。IB檢測(cè)證實(shí)了YTHDC2的過(guò)表達(dá)和敲除效率(圖2G和S2A)。然而在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)YTHDC2WT后,腫瘤3D球體的數(shù)量和大小以及異種移植瘤的生長(zhǎng)下降,但在過(guò)表達(dá)YTHDC2ΔYTH時(shí)沒(méi)有觀察到這些現(xiàn)象(圖2 H-K)。相比之下,敲除H1975細(xì)胞中的YTHDC2增加了小鼠的球體形成和異種移植瘤的生長(zhǎng)(圖S2B-E)。值得注意的是,當(dāng)使用YTHDC2sg2?resistant (res)重組YTHDC2表達(dá)時(shí),YTHDC2sg2在腫瘤發(fā)生中的陽(yáng)性作用得到了恢復(fù)(圖S2B-E)。因此,YTHDC2通過(guò)其m6A閱讀域在LUAD中發(fā)揮腫瘤抑制功能。
圖2 過(guò)表達(dá)YTHDC2抑制細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生
圖S2 敲除YTHDC2促進(jìn)細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生
為了研究YTHDC2對(duì)代謝物的影響,作者對(duì)YTHDC2低表達(dá)和高表達(dá)的LUAD標(biāo)本(分別稱為YTHDC2low和YTHDC2high)進(jìn)行代謝組學(xué)分析(n = 20/組)。如圖3A顯示,GSH代謝在KEGG通路中排名前20。在顯著改變的代謝產(chǎn)物中,與YTHDC2high的腫瘤相比,YTHDC2low的腫瘤中胱氨酸含量增加了3.975倍(圖3B)。此外,在cohort #1 (n = 100)中,YTHDC2和胞內(nèi)胱氨酸呈負(fù)相關(guān)(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2減少了細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸。
L-14c-胱氨酸攝取試驗(yàn)結(jié)果顯示,YTHDC2通過(guò)其YTH域抑制了H1299細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植物、小鼠形成的LUAD和患者來(lái)源的LUAD細(xì)胞的胱氨酸攝取(圖3D-F)。圖3H證明了系統(tǒng)Xc功能受損與GSH水平降低相關(guān)。NAC和GSH給藥后,KPYWT小鼠的腫瘤負(fù)荷明顯高于給藥對(duì)照小鼠,且水平與KPE小鼠相似(圖3H、I)。與KPE小鼠相比,GSH和NAC給藥僅導(dǎo)致KPYWT小鼠腫瘤中GSH/GSSG比值顯著增加。NAC和GSH的補(bǔ)充降低了KPYWT小鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化并縮短了存活時(shí)間(圖3K、L)。
圖3 YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸攝取和下游抗氧化程序
4. YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取
Xc-系統(tǒng)是一個(gè)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,捕獲細(xì)胞外的胱氨酸,用于谷胱甘肽的合成,以交換谷氨酸的釋放。在圖3中,被抑制的Xc-系統(tǒng)功能與YTHDC2受損的胱氨酸攝取有關(guān),然而YTHDC2如何調(diào)節(jié)Xc-系統(tǒng)依然未知。文獻(xiàn)報(bào)道催化亞基SLC7A11在維持Xc-系統(tǒng)活性方面起著重要作用。作者通過(guò)IB 和RT-qPCR發(fā)現(xiàn),SLC7A11蛋白和mRNA水平均受YTHDC2負(fù)調(diào)控(圖4A、B)。在小鼠中,與KPE和KPYΔYTH小鼠相比,KPYWT小鼠的腫瘤中SLC7A11表達(dá)下調(diào)(圖4C、D)。這證明YTH結(jié)構(gòu)域是YTHDC2抑制SLC7A11表達(dá)的前提。
隨后,作者研究了YTHDC2是否通過(guò)SLC7A11抑制胱氨酸攝取。當(dāng)YTHDC2在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí),并過(guò)表達(dá)SLC7A11完全恢復(fù)了受損的胱氨酸攝取(圖4E-G)。ATF4是SLC7A11轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,ATF4在H1299細(xì)胞中上調(diào)SLC7A11(圖4H、I)。過(guò)表達(dá)YTHDC2仍然拮抗ATF4的作用(圖4H-J)。因此,YTHDC2損害依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取。結(jié)合臨床分析,YTHDC2表達(dá)下調(diào),而SLC7A11表達(dá)上調(diào)(圖4K、L),并且它們?cè)谀[瘤中呈負(fù)相關(guān)(圖4M)。
圖4 YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取
5. YTHDC2以m6A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定
作者為研究YTHDC2是否在轉(zhuǎn)錄被阻斷后調(diào)控SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性,通過(guò)泛轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD處理H1299和H1975細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)YTH結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span>YTHDC2縮短H1299細(xì)胞中SLC7A11 mRNA的半衰期至關(guān)重要(圖5A)。在H1975細(xì)胞中,CRISPR/Cas9技術(shù)使YTHDC2功能喪失,然后YTHDC2重構(gòu),進(jìn)一步證實(shí)YTHDC2加速了SLC7A11 mRNA的衰變(圖5B)。EXOSC10是一種外切酶,負(fù)責(zé)3’-5’外切酶活性。EXOSC10的缺失,減弱了YTHDC2縮短SLC7A11 mRNA半衰期的作用(圖5C、D)。在藥理學(xué)水平上,用兩種泛-RNase抑制劑DEPC和RNasin治療H1299細(xì)胞,也阻斷了YTHDC2的功能(圖5D)。
YTHDC2調(diào)節(jié)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性(圖5A-D),而控制RNA衰減是m6A甲基化的重要功能之一。作者先驗(yàn)證METTL3刺激m6A的能力(圖5E、F)。在H1975細(xì)胞中敲降METTL3延長(zhǎng)了SLC7A11 mRNA的半衰期,而在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3則加速了SLC7A11 mRNA的降解(圖5G)。此外,H1299細(xì)胞中降低METTL3表達(dá)阻斷了YTHDC2,從而減緩SLC7A11 mRNA的衰減,刺激胱氨酸攝取并減弱脂質(zhì)活性氧(ROS)的生成(圖5H-J),這表明YTHDC2在LUAD細(xì)胞中的作用是依賴m6A。
圖5 YTHDC2以m6A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定
6. YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定
為了揭示SLC7A11 mRNA中潛在的m6A甲基化位點(diǎn),在H1975細(xì)胞中METTL3敲除前后分別進(jìn)行了MeRIP-seq研究。在H1975細(xì)胞中,無(wú)論是否敲除METTL3, GGAC motif都高度富集于m6A位點(diǎn)(圖6A)。m6A峰在mRNA停止密碼子附近的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)尤為豐富(圖6B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SLC7A11 mRNA的m6A依賴性修飾,我們進(jìn)行MeRIP-qPCR。在H1975細(xì)胞中,敲除METTL3后,SLC7A11 mRNA中的m6A修飾明顯減少,特別是在假定的m6A位點(diǎn)周圍。相反,當(dāng)METTL3在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí),觀察到相反的結(jié)果(圖6C)。
作者進(jìn)行了PAR-CLIP實(shí)驗(yàn),以評(píng)估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結(jié)果表明,在H1299細(xì)胞中,通過(guò)過(guò)表達(dá)METTL3來(lái)提高m6A的甲基化水平,促進(jìn)YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結(jié)合(圖6D)。無(wú)論METTL3是否過(guò)表達(dá),YTH結(jié)構(gòu)域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過(guò)SLC7A11 3’-UTR探針進(jìn)行RNA-pull down實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)YTHDC2WT,優(yōu)先結(jié)合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR,而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外,YTHDC2傾向于結(jié)合m6A共識(shí)基元GGAC (圖6E)。通過(guò)在H1299和H1975細(xì)胞中進(jìn)行METTL3的功能增加和丟失實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平?jīng)Q定的(圖6F和G)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結(jié)合。
作者構(gòu)建了 (WT) SLC7A113’-UTR和突變型(Mut) 3’-UTR兩種質(zhì)粒(圖6H)。結(jié)果表明,只有過(guò)表達(dá)YTHDC2WT降低SLC7A11 mRNA在H1299細(xì)胞中的穩(wěn)定性,敲除YTHDC2可以提高SLC7A11 mRNA在H1975細(xì)胞中的穩(wěn)定性。然而,與WT 3’-UTR相比,Mut報(bào)告基因的這些作用減弱(圖6I和J)。在檢測(cè)外源性F-Luc-SLC7A11融合mRNA的RNA穩(wěn)定性后,得到了類似的結(jié)果(圖6K-M)??偟膩?lái)說(shuō),3’-UTR上的m6A位點(diǎn)對(duì)于YTHDC2使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定至關(guān)重要。
圖6 YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定
7. 抑制YTHDC2對(duì)XC-系統(tǒng)靶向治療敏感,并與LUAD進(jìn)展相關(guān)
為了評(píng)估YTHDC2抑制在LUAD中的重要性,從cohort #1隨機(jī)抽取20例YTHDC2low LUAD,其中50%屬于腺泡型(圖7A)。在cohort #2中,與相鄰組織相比,腫瘤中YTHDC2表達(dá)下調(diào),62%(62/100)的腺泡組織被歸類為YTHDC2low(圖7B、C)。與無(wú)這種表達(dá)模式的腺泡性LUAD患者相比,YTHDC2low的患者總生存期要短得多(圖7D),進(jìn)一步表明YTHDC2抑制可能對(duì)腺泡性LUAD的腫瘤進(jìn)展尤為重要。另外,相對(duì)于癌旁組織,腫瘤中腺泡LUAD組織中SLC7A11 mRNA和蛋白水平表達(dá)量都比較高(圖7E、F)。
來(lái)自4個(gè)不同腺泡性LUAD患者的PDX模型被給予XC-系統(tǒng)抑制劑erastin (PKE)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)。與DMSO治療的對(duì)照組相比,PKE和sorafenib給藥時(shí)觀察到顯著的腫瘤消退(圖7G-J)。此外,PKE和sorafenib給藥小鼠也導(dǎo)致腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加(圖7K和L),提示誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化可能是抑制腺泡LUADs腫瘤發(fā)生的結(jié)果。
圖7M顯示,與癌旁組織相比,癌癥組織中MDA和YTHDC2表達(dá)量都降低,而SLC7A11 mRNA和蛋白水平都升高,證明在LUAD中抑制YTHDC2可通過(guò)SLC7A11表達(dá)上調(diào)阻止脂質(zhì)過(guò)氧化。同樣地,MDA和YTHDC2與癌癥期數(shù)呈負(fù)相關(guān),而SLC7A11與分期呈正相關(guān)(圖7N),說(shuō)明SLC7A11的升高可能是抑制YTHDC2促進(jìn)LUAD進(jìn)展的關(guān)鍵。
圖7 抑制YTHDC2對(duì)XC-系統(tǒng)靶向治療敏感,并與LUAD進(jìn)展相關(guān)
結(jié)論:
本研究強(qiáng)調(diào)了m6A閱讀器YTHDC2在LUAD中的重要性。XC?系統(tǒng)活性可能通過(guò)抑制YTHDC2來(lái)誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。此外,基于YTHDC2表達(dá)的分子模型可能有助于預(yù)測(cè)LUAD的預(yù)后。抑制劑靶向XC?系統(tǒng)可能有助于治療預(yù)后不良的LUAD患者。因此,本研究對(duì)LUAD的腫瘤發(fā)生、分子分型和藥物敏感性提供了有價(jià)值的見(jiàn)解。
研究模型通路
參考文獻(xiàn):
Ma, L., Chen, T., Zhang, X., Miao, Y., Tian, X., Yu, K., Xu, X., Niu, Y., Guo, S., Zhang, C., Qiu, S., Qiao, Y., Fang, W., Du, L., Yu, Y., Wang, J. (2021). The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol., 38:101801. doi:10.1016/j.redox.2020.101801