m6A閱讀器YTHDC2通過抑制SLC7A11依賴的抗氧化功能來抑制肺腺癌的發(fā)生

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2021-08-04
m6A甲基化的最終結(jié)果取決于特異性閱讀器的識別并結(jié)合。目前研究發(fā)現(xiàn)抑制肺腺癌(LUAD)與m6A閱讀器YTHDC2相關(guān)......


m6A RNA甲基化是mRNA轉(zhuǎn)錄后最常見的內(nèi)部甲基化。這是一個(gè)由m6A WER系統(tǒng)控制的可逆過程，由書寫器(W)、擦除器(E)和閱讀器(R)組成，而m6A甲基化的最終結(jié)果取決于特異性閱讀器的識別并結(jié)合。目前研究發(fā)現(xiàn)抑制肺腺癌(LUAD)與m6A閱讀器YTHDC2相關(guān)。該研究2021年1月發(fā)表在《Redox biology》，IF：11.799的期刊上。


技術(shù)路線：




主要結(jié)果如下：

1. YTHDC2表達(dá)在LUAD中被抑制，且與臨床預(yù)后差相關(guān)

為了驗(yàn)證m6A閱讀器在肺癌的表達(dá)，作者通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了LUAD中已知的閱讀器，包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1和IGF2BP1/2。如圖1A和B顯示，與正常肺相比，LUAD 中YTHDC2、IGF2BP2表達(dá)下調(diào)，而結(jié)合Oncomine數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier圖譜進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)較低的YTHDC2與LUAD患者較差的總生存率相關(guān)(圖1D)，這證實(shí)了YTHDC2與LUAD存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

接著作者為了進(jìn)一步證明YTHDC2與LUAD的關(guān)系，與相鄰的癌旁組織相比，在LUAD腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA和蛋白的顯著下調(diào)(圖1E-G)，組織芯片檢測(TMA)評估cohort #1中YTHDC2的表達(dá)，結(jié)果顯示51% (98/192) LUAD患者的YTHDC2表達(dá)下調(diào)(圖1H、I)。值得注意的是，YTHDC2表達(dá)下調(diào)與更大的腫瘤直徑和更晚期的分期相關(guān)(圖1J、K)。表明抑制YTHDC2可促進(jìn)LUAD的腫瘤進(jìn)展。


圖1 YTHDC2表達(dá)在LUAD中被抑制，且與臨床預(yù)后差相關(guān)

 

2. 過表達(dá)YTHDC2抑制細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生

為了探索YTHDC2在體內(nèi)的m6A解讀器功能，作者構(gòu)建AAV5表達(dá)系統(tǒng)(KPYWT、KPYΔYTH和對照KPE)(圖2A)。與KPE小鼠感染25周后的腫瘤相比，KPYWT和KPYΔYTH小鼠的腫瘤證實(shí)了YTHDC2持續(xù)上調(diào)(圖2B)，這表明AAV5表達(dá)系統(tǒng)具有持久的效率。雖然YTHDC2不能阻止腫瘤的發(fā)生，但腫瘤發(fā)生時(shí)間延遲，腫瘤負(fù)荷明顯受到抑制，KPYWT小鼠的生存時(shí)間比KPE小鼠和KPYΔYTH小鼠更長(圖2C-F)。

作者進(jìn)一步研究YTHDC2是否是存在人類LUAD細(xì)胞中的一種腫瘤抑制因子。IB檢測證實(shí)了YTHDC2的過表達(dá)和敲除效率(圖2G和S2A)。然而在H1299細(xì)胞中過表達(dá)YTHDC2WT后，腫瘤3D球體的數(shù)量和大小以及異種移植瘤的生長下降，但在過表達(dá)YTHDC2ΔYTH時(shí)沒有觀察到這些現(xiàn)象(圖2 H-K)。相比之下，敲除H1975細(xì)胞中的YTHDC2增加了小鼠的球體形成和異種移植瘤的生長(圖S2B-E)。值得注意的是，當(dāng)使用YTHDC2sg2?resistant (res)重組YTHDC2表達(dá)時(shí)，YTHDC2sg2在腫瘤發(fā)生中的陽性作用得到了恢復(fù)(圖S2B-E)。因此，YTHDC2通過其m6A閱讀域在LUAD中發(fā)揮腫瘤抑制功能。


圖2 過表達(dá)YTHDC2抑制細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生


圖S2    敲除YTHDC2促進(jìn)細(xì)胞活力和腫瘤發(fā)生


3. YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

為了研究YTHDC2對代謝物的影響，作者對YTHDC2低表達(dá)和高表達(dá)的LUAD標(biāo)本(分別稱為YTHDC2low和YTHDC2high)進(jìn)行代謝組學(xué)分析(n = 20/組)。如圖3A顯示，GSH代謝在KEGG通路中排名前20。在顯著改變的代謝產(chǎn)物中，與YTHDC2high的腫瘤相比，YTHDC2low的腫瘤中胱氨酸含量增加了3.975倍(圖3B)。此外，在cohort #1 (n = 100)中，YTHDC2和胞內(nèi)胱氨酸呈負(fù)相關(guān)(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2減少了細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸。

L-14c-胱氨酸攝取試驗(yàn)結(jié)果顯示，YTHDC2通過其YTH域抑制了H1299細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植物、小鼠形成的LUAD和患者來源的LUAD細(xì)胞的胱氨酸攝取(圖3D-F)。圖3H證明了系統(tǒng)Xc功能受損與GSH水平降低相關(guān)。NAC和GSH給藥后，KPYWT小鼠的腫瘤負(fù)荷明顯高于給藥對照小鼠，且水平與KPE小鼠相似(圖3H、I)。與KPE小鼠相比，GSH和NAC給藥僅導(dǎo)致KPYWT小鼠腫瘤中GSH/GSSG比值顯著增加。NAC和GSH的補(bǔ)充降低了KPYWT小鼠的脂質(zhì)過氧化并縮短了存活時(shí)間(圖3K、L)。


圖3 YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸攝取和下游抗氧化程序


4. YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取

Xc-系統(tǒng)是一個(gè)胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，捕獲細(xì)胞外的胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成，以交換谷氨酸的釋放。在圖3中，被抑制的Xc-系統(tǒng)功能與YTHDC2受損的胱氨酸攝取有關(guān)，然而YTHDC2如何調(diào)節(jié)Xc-系統(tǒng)依然未知。文獻(xiàn)報(bào)道催化亞基SLC7A11在維持Xc-系統(tǒng)活性方面起著重要作用。作者通過IB 和RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，SLC7A11蛋白和mRNA水平均受YTHDC2負(fù)調(diào)控(圖4A、B)。在小鼠中，與KPE和KPYΔYTH小鼠相比，KPYWT小鼠的腫瘤中SLC7A11表達(dá)下調(diào)(圖4C、D)。這證明YTH結(jié)構(gòu)域是YTHDC2抑制SLC7A11表達(dá)的前提。

隨后，作者研究了YTHDC2是否通過SLC7A11抑制胱氨酸攝取。當(dāng)YTHDC2在H1299細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，并過表達(dá)SLC7A11完全恢復(fù)了受損的胱氨酸攝取(圖4E-G)。ATF4是SLC7A11轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，ATF4在H1299細(xì)胞中上調(diào)SLC7A11(圖4H、I)。過表達(dá)YTHDC2仍然拮抗ATF4的作用(圖4H-J)。因此，YTHDC2損害依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取。結(jié)合臨床分析，YTHDC2表達(dá)下調(diào)，而SLC7A11表達(dá)上調(diào)(圖4K、L)，并且它們在腫瘤中呈負(fù)相關(guān)(圖4M)。


圖4 YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取


5. YTHDC2以m6A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定

作者為研究YTHDC2是否在轉(zhuǎn)錄被阻斷后調(diào)控SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性，通過泛轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD處理H1299和H1975細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)YTH結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span>YTHDC2縮短H1299細(xì)胞中SLC7A11 mRNA的半衰期至關(guān)重要(圖5A)。在H1975細(xì)胞中，CRISPR/Cas9技術(shù)使YTHDC2功能喪失，然后YTHDC2重構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)YTHDC2加速了SLC7A11 mRNA的衰變(圖5B)。EXOSC10是一種外切酶，負(fù)責(zé)3’-5’外切酶活性。EXOSC10的缺失，減弱了YTHDC2縮短SLC7A11 mRNA半衰期的作用(圖5C、D)。在藥理學(xué)水平上，用兩種泛-RNase抑制劑DEPC和RNasin治療H1299細(xì)胞，也阻斷了YTHDC2的功能(圖5D)。

YTHDC2調(diào)節(jié)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性(圖5A-D)，而控制RNA衰減是m6A甲基化的重要功能之一。作者先驗(yàn)證METTL3刺激m6A的能力(圖5E、F)。在H1975細(xì)胞中敲降METTL3延長了SLC7A11 mRNA的半衰期，而在H1299細(xì)胞中過表達(dá)METTL3則加速了SLC7A11 mRNA的降解(圖5G)。此外，H1299細(xì)胞中降低METTL3表達(dá)阻斷了YTHDC2，從而減緩SLC7A11 mRNA的衰減，刺激胱氨酸攝取并減弱脂質(zhì)活性氧(ROS)的生成(圖5H-J)，這表明YTHDC2在LUAD細(xì)胞中的作用是依賴m6A。


圖5 YTHDC2以m6A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定


6. YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定

為了揭示SLC7A11 mRNA中潛在的m6A甲基化位點(diǎn)，在H1975細(xì)胞中METTL3敲除前后分別進(jìn)行了MeRIP-seq研究。在H1975細(xì)胞中，無論是否敲除METTL3, GGAC motif都高度富集于m6A位點(diǎn)(圖6A)。m6A峰在mRNA停止密碼子附近的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)尤為豐富(圖6B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SLC7A11 mRNA的m6A依賴性修飾，我們進(jìn)行MeRIP-qPCR。在H1975細(xì)胞中，敲除METTL3后，SLC7A11 mRNA中的m6A修飾明顯減少，特別是在假定的m6A位點(diǎn)周圍。相反，當(dāng)METTL3在H1299細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，觀察到相反的結(jié)果(圖6C)。

作者進(jìn)行了PAR-CLIP實(shí)驗(yàn)，以評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m6A甲基化。結(jié)果表明，在H1299細(xì)胞中，通過過表達(dá)METTL3來提高m6A的甲基化水平，促進(jìn)YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結(jié)合(圖6D)。無論METTL3是否過表達(dá)，YTH結(jié)構(gòu)域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進(jìn)行RNA-pull down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)YTHDC2WT，優(yōu)先結(jié)合于含有m6A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結(jié)合m6A共識基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細(xì)胞中進(jìn)行METTL3的功能增加和丟失實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m6A水平?jīng)Q定的(圖6F和G)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先與m6A甲基化的SLC7A11 mRNA結(jié)合。

作者構(gòu)建了 (WT) SLC7A113’-UTR和突變型(Mut) 3’-UTR兩種質(zhì)粒(圖6H)。結(jié)果表明，只有過表達(dá)YTHDC2WT降低SLC7A11 mRNA在H1299細(xì)胞中的穩(wěn)定性，敲除YTHDC2可以提高SLC7A11 mRNA在H1975細(xì)胞中的穩(wěn)定性。然而，與WT 3’-UTR相比，Mut報(bào)告基因的這些作用減弱(圖6I和J)。在檢測外源性F-Luc-SLC7A11融合mRNA的RNA穩(wěn)定性后，得到了類似的結(jié)果(圖6K-M)?？偟膩碚f，3’-UTR上的m6A位點(diǎn)對于YTHDC2使SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定至關(guān)重要。


圖6 YTHDC2傾向于相互作用并使m6A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩(wěn)定


7. 抑制YTHDC2對XC-系統(tǒng)靶向治療敏感，并與LUAD進(jìn)展相關(guān)

為了評估YTHDC2抑制在LUAD中的重要性，從cohort #1隨機(jī)抽取20例YTHDC2low LUAD，其中50%屬于腺泡型(圖7A)。在cohort #2中，與相鄰組織相比，腫瘤中YTHDC2表達(dá)下調(diào)，62%(62/100)的腺泡組織被歸類為YTHDC2low(圖7B、C)。與無這種表達(dá)模式的腺泡性LUAD患者相比，YTHDC2low的患者總生存期要短得多(圖7D)，進(jìn)一步表明YTHDC2抑制可能對腺泡性LUAD的腫瘤進(jìn)展尤為重要。另外，相對于癌旁組織，腫瘤中腺泡LUAD組織中SLC7A11 mRNA和蛋白水平表達(dá)量都比較高(圖7E、F)。

來自4個(gè)不同腺泡性LUAD患者的PDX模型被給予XC-系統(tǒng)抑制劑erastin (PKE)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)。與DMSO治療的對照組相比，PKE和sorafenib給藥時(shí)觀察到顯著的腫瘤消退(圖7G-J)。此外，PKE和sorafenib給藥小鼠也導(dǎo)致腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加(圖7K和L)，提示誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可能是抑制腺泡LUADs腫瘤發(fā)生的結(jié)果。

圖7M顯示，與癌旁組織相比，癌癥組織中MDA和YTHDC2表達(dá)量都降低，而SLC7A11 mRNA和蛋白水平都升高，證明在LUAD中抑制YTHDC2可通過SLC7A11表達(dá)上調(diào)阻止脂質(zhì)過氧化。同樣地，MDA和YTHDC2與癌癥期數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而SLC7A11與分期呈正相關(guān)(圖7N)，說明SLC7A11的升高可能是抑制YTHDC2促進(jìn)LUAD進(jìn)展的關(guān)鍵。


圖7 抑制YTHDC2對XC-系統(tǒng)靶向治療敏感，并與LUAD進(jìn)展相關(guān)


結(jié)論：

本研究強(qiáng)調(diào)了m6A閱讀器YTHDC2在LUAD中的重要性。XC?系統(tǒng)活性可能通過抑制YTHDC2來誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。此外，基于YTHDC2表達(dá)的分子模型可能有助于預(yù)測LUAD的預(yù)后。抑制劑靶向XC?系統(tǒng)可能有助于治療預(yù)后不良的LUAD患者。因此，本研究對LUAD的腫瘤發(fā)生、分子分型和藥物敏感性提供了有價(jià)值的見解。


研究模型通路


參考文獻(xiàn)：

Ma, L., Chen, T., Zhang, X., Miao, Y., Tian, X., Yu, K., Xu, X., Niu, Y., Guo, S., Zhang, C., Qiu, S., Qiao, Y., Fang, W., Du, L., Yu, Y., Wang, J. (2021). The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol., 38:101801. doi:10.1016/j.redox.2020.101801