USP35通過靶向鐵轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)肺癌鐵死亡

鐵死亡對調(diào)節(jié)腫瘤生長至關(guān)重要，是一種很有前途的肺癌治療靶點。泛素特異性蛋白酶35 (USP35)屬于deubiquitinases家族，與細(xì)胞增殖和有絲分裂有關(guān)。于2021年4月發(fā)表于“Clin. Transl. Med”（IF=11.492）的文章“Deubiquitinase USP35 modulates ferroptosis in lung cancer via targeting ferroportin”對此展開了研究。本研究旨在闡明USP35在肺癌中的潛在作用和分子基礎(chǔ)。研究表明USP35在人肺癌組織和細(xì)胞系中大量存在。USP35敲除促進鐵死亡，抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長、集落形成和腫瘤進展。USP35過表達(dá)在基礎(chǔ)條件下不影響腫瘤發(fā)生和鐵死亡，但減少erastin/RSL3觸發(fā)的鐵紊亂和鐵死亡，從而促進肺癌細(xì)胞生長和腫瘤進展。進一步的研究確定USP35直接與鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN)相互作用，并作為一種雙激酶來維持其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。更重要的是，我們觀察到USP35敲除使肺癌細(xì)胞對順鉑和紫杉醇化療敏感?？偠灾?，USP35通過靶向FPN調(diào)節(jié)肺癌鐵死亡，是一個很有前途的肺癌治療靶點。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）USP35敲除抑制肺癌細(xì)胞生長、集落形成和腫瘤進展

我們首先檢測了肺癌組織和細(xì)胞系中USP35豐度的變化。如圖1A所示，USP35在肺ADC和SCC腫瘤中都顯著上調(diào)。與正常的BEAS2B和HBE肺上皮細(xì)胞系相比，USP35 mRNA水平在肺癌細(xì)胞系(A549、H358、H460、H1299和H1650)中也高度表達(dá)(圖1B)。鑒于H460和H 1299細(xì)胞中USP35 mRNA的豐度較高，我們在下一項研究中使用了這兩種細(xì)胞系。與mRNA水平一致，在H460和H1299細(xì)胞中USP35蛋白也增加了(圖1C)。為了闡明USP35在肺癌發(fā)病機制中的作用，我們在H460和H1299細(xì)胞中沉默了USP35(圖1D)。有趣的是，USP35敲除抑制了H460和H1299細(xì)胞在體外的生長能力和集落形成(圖1E、F)。來自腫瘤異種移植實驗的數(shù)據(jù)進一步表明，USP35沉默抑制了25天生長后的腫瘤體積和重量(圖1G，H)?？傊?，USP35在調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞生長和腫瘤進展中起著關(guān)鍵作用。

2）USP35敲除促進肺癌細(xì)胞的鐵死亡

我們研究了shUSP35介導(dǎo)的腫瘤抑制是否可歸因于細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)。如圖2A，B所示，用Nec-1，Z-VAD和CQ治療以抑制壞死、凋亡和自噬并不影響細(xì)胞凋亡，表明可能涉及其他形式的細(xì)胞死亡。鐵死亡是一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，它與包括肺癌在內(nèi)的腫瘤生長的發(fā)病機制有關(guān)。因此，我們使用兩種鐵死亡抑制劑，Fer-1和Lip-1，探索了鐵死亡是否導(dǎo)致USP35沉默后的肺細(xì)胞死亡。如圖2A，B所示，鐵死亡抑制阻斷了H460和H1299細(xì)胞中shUSP35介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在shUSP35感染的細(xì)胞中，集落形成被抑制，但被Fer-1和Lip 1破壞(圖2C)。USP35敲除增加了脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生和丙二醛的產(chǎn)生(圖2D)。過量的活性氧導(dǎo)致多不飽和脂肪酸氧化損傷并分裂成各種產(chǎn)物，包括HETEs。我們觀察到，USP35沉默促進了H460和H1299細(xì)胞中5-HETE、11-HETE和15-HETE的釋放，而不影響12-HETE的釋放(圖2F)。GSH/GPX4為基礎(chǔ)的ROS清除機制在防止鐵缺乏期間的脂質(zhì)過氧化中起著不可或缺的作用。研究表明在USP35缺乏的細(xì)胞中GSH水平降低并伴隨著對GPX4活性的抑制(圖2G，H)。此外，shUSP35感染細(xì)胞中的鐵和Fe2+水平顯著高于對照組。相比之下，補充GSH或鐵螯合劑顯著減少了shUSP35感染細(xì)胞的細(xì)胞死亡和集落形成(圖2K，L)。因此，我們得出結(jié)論，鐵死亡有助于USP35敲除誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞死亡。

 
3）USP35過表達(dá)阻斷erastin/RSL3介導(dǎo)的腫瘤抑制作用

細(xì)胞也用慢病毒載體感染以在體外過表達(dá)USP35，并通過PCR驗證其效率(圖3A)。然而，在基礎(chǔ)條件下，USP35過表達(dá)不影響H460和H1299細(xì)胞的細(xì)胞死亡和集落形成(圖3B，C)。裸鼠的腫瘤體積和重量也不受USP35過表達(dá)的影響(圖3D，E)。我們進一步研究了USP35操作是否對鐵刺激引起的細(xì)胞死亡有影響。不出所料，erastin或RSL3處理顯著降低了H460和H1299細(xì)胞的細(xì)胞活力或集落形成，而這是通過USP35過表達(dá)來阻止的(圖3F，G)。相應(yīng)地，接種CTRL肺癌細(xì)胞的裸鼠在erastin或RSL3治療后腫瘤體積和重量減少；然而，這些腫瘤抑制作用被USP35過表達(dá)阻斷(圖3H，I)?？偟膩碚f，USP35過表達(dá)阻斷了erastin/RSL33介導(dǎo)的腫瘤抑制作用。

4）USP35過表達(dá)減少erastin/RSL3觸發(fā)的鐵紊亂和鐵死亡

erastin和RLS3誘導(dǎo)的ROS和MDA生成因USP35過表達(dá)而減少(圖4A，B)。此外，在erastin和RLS3處理的癌細(xì)胞中，HETEs水平升高，但在除12-HETE外的USP35過表達(dá)的癌細(xì)胞中，HETEs水平降低(圖4C，F)。然而，USP35過表達(dá)對GSH含量和GPX4活性沒有影響(圖4G，H)。如圖4I，J所示，USP35的過表達(dá)顯著減弱了用erastin或RSL3刺激H460和H1299細(xì)胞誘導(dǎo)LIP和Fe2+的作用。與表型改變一致，在基礎(chǔ)條件下，USP35過表達(dá)對鐵代謝和鐵死亡也沒有影響(圖4A，J)。H460和H1299細(xì)胞是表皮生長因子受體(EGFR)野生型細(xì)胞，我們進一步確定了在EGFR突變的H1650細(xì)胞中，USP35對細(xì)胞生長、鐵死亡誘導(dǎo)和腫瘤生長的作用。如圖5A-C所示，USP35沉默顯著減少了H1650細(xì)胞生長、集落形成和腫瘤進展。因此，在USP 35缺陷型H1650細(xì)胞中，ROS生成、MDA生成、細(xì)胞內(nèi)LIP和Fe2+增加，而GSH水平和GPX4活性降低(圖5D-F)。相反，USP35過表達(dá)顯著阻止了erastin/RSL3誘導(dǎo)的體內(nèi)外對H1650細(xì)胞生長、集落形成和腫瘤進展的抑制(圖5G-J)。在H1650細(xì)胞中過表達(dá)USP35也降低了ROS生成、MDA產(chǎn)生和鐵負(fù)荷的增加(圖5K-M)?？偟膩碚f，USP35過表達(dá)減少了erastin/RSL3觸發(fā)的鐵紊亂和鐵死亡。

 
5）USP35通過靶向FPN調(diào)節(jié)鐵下垂

我們接下來試圖闡明USP35對鐵死亡的可能機制。負(fù)責(zé)鐵輸入的蛋白質(zhì)(Tf和TfR)沒有改變；然而，哺乳動物中關(guān)鍵的鐵轉(zhuǎn)運蛋白FPN在USP35缺乏的細(xì)胞中減少，而在過表達(dá)的細(xì)胞中增加(圖6A-C)。在USP35過表達(dá)的癌細(xì)胞中，細(xì)胞膜中的FPN蛋白豐度增加，但由于USP35的敲除而降低(圖6D)。與分子變化一致，在USP35沉默或過表達(dá)的細(xì)胞中，胱氨酸攝取也不受影響(圖6E)。為了進一步證實FPN的參與，H460和H1299細(xì)胞分別預(yù)感染shFPN以敲低內(nèi)源性FPN表達(dá)。USP35過表達(dá)在鐵刺激時降低了肺癌細(xì)胞內(nèi)LIP和Fe2+，但在FPN缺陷細(xì)胞中未能做到這一點(圖6F)。此外，在敲除內(nèi)源性FPN后，USP35過表達(dá)引起的ROS和丙二醛生成的減少也被減緩(圖6G)。我們還評估了體內(nèi)和體外RSL3治療后FPN在肺癌細(xì)胞或腫瘤異種移植中的作用。如圖7A-C所示，FPN敲除恢復(fù)了USP35過表達(dá)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)LIP和Fe2+水平，同時增加了ROS和MDA的形成。與此同時，FPN敲除后，由于USP35過表達(dá)而增加的細(xì)胞活力和集落形成也被逆轉(zhuǎn)(圖7D-F)。根據(jù)體外數(shù)據(jù)，FPN敲除后，USP35過表達(dá)細(xì)胞的腫瘤體積和重量均有所減少(圖7G，H)。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)FPN的膜分布在肺ADC和SCC腫瘤中顯著增加(圖7I)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明FPN是USP35調(diào)節(jié)鐵死亡和腫瘤進展的潛在靶點。

 
6）FPN蛋白在肺癌細(xì)胞中的穩(wěn)定性需要USP35

USP35屬于DUBs家族，在控制各種蛋白質(zhì)的Ub依賴性降解中起關(guān)鍵作用。此外，FPN泛素化和隨后的內(nèi)吞作用導(dǎo)致鐵超載和鐵死亡。因此，我們研究了USP35是否通過影響其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)FPN表達(dá)。如圖8A所示，USP35敲除增加，而USP35過表達(dá)降低泛素化FPN水平。用MG132蛋白酶體抑制劑治療后，shUSP35感染細(xì)胞的全部或膜裂解物中FPN水平的降低被阻止(圖8B)。隨后，我們檢查了USP35是否是FPN的直接結(jié)合伙伴。IP分析的數(shù)據(jù)揭示了內(nèi)源性USP35和FPN之間的聯(lián)系(圖8C)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明USP35可以直接與FPN相互作用，并作為deubiquitinase發(fā)揮作用，以保持其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

7）USP35敲除增強肺癌細(xì)胞的化療敏感性

鑒于USP35在肺癌細(xì)胞中的高表達(dá)及其在調(diào)節(jié)鐵死亡中的作用，我們最終評估了USP35沉默是否能使肺癌細(xì)胞對化療藥物敏感。如圖9A-C所示，USP35缺乏的H460和H1299細(xì)胞在體外對DDP和PTX的毒性作用更敏感，細(xì)胞活力和定殖的降低證明了這一點。相應(yīng)地，接種USP35缺陷癌細(xì)胞的荷瘤小鼠經(jīng)DDP或PTX治療后腫瘤體積和重量均減少(圖9D，E)。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)已成為常規(guī)化療的替代藥物，并為肺癌患者提供了顯著的生存益處。然后，我們在H460和H1299細(xì)胞中測量了USP35敲除和TKI之間的協(xié)同效應(yīng)，數(shù)據(jù)表明USP35沉默在體內(nèi)和體外使H460和H1299細(xì)胞對GFB化療敏感(圖9F-H)。值得注意的是，EGFR突變的肺癌細(xì)胞對TKI更敏感，因此我們評估了USP35沉默是否會使H1650細(xì)胞對GFB化療敏感。如圖9I，J所示，USP35沉默進一步抑制了GFB治療后H1650細(xì)胞的生長、集落形成和腫瘤進展。總的來說，USP35缺乏的肺癌細(xì)胞對化療藥物更敏感。

結(jié)論：FPN蛋白穩(wěn)定性和肺癌細(xì)胞的鐵輸出需要USP35，從而保持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)和腫瘤生長。而USP35敲除通過減少游離鐵輸出增加細(xì)胞內(nèi)LIP水平和鐵死亡，并伴隨著肺癌細(xì)胞生長、定殖和腫瘤形成的減少，以及對DDP和PTX化學(xué)敏感性的增加。因此USP35是一個很有前途的肺癌治療靶點。