癌癥免疫治療新貢獻(xiàn)——單胺氧化酶A

靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是一種很有前途的策略，可以改變免疫抑制腫瘤微環(huán)境，改善腫瘤免疫治療。單胺氧化酶A (MAO-A)是一種因其在大腦中的功能而著名的酶，小分子MAO抑制劑(MAOIs)用于臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這里作者發(fā)現(xiàn)MAO-A誘導(dǎo)人和小鼠的TAMs進(jìn)而可用于癌癥的免疫治療。該文2021年6月發(fā)表于《nature communications》IF：14.919期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、MAO-A缺陷小鼠顯示與TAM極化改變相關(guān)的腫瘤生長減少

將同基因B16-OVA黑色素瘤接種給C57BL/6J小鼠，分離出TAM并評(píng)估TAM基因表達(dá)譜。除了參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的經(jīng)典基因的變化，還觀察到一個(gè)Maoa基因在TAMs中的上調(diào)表達(dá)（圖1a），這表明MAO-A可能參與了TAM活性的調(diào)節(jié)。首先構(gòu)建MAO-A缺陷的小鼠，然后接種B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，與野生型相比，MAO-A缺陷小鼠的腫瘤生長被顯著抑制（圖1b-d）。流式檢測(cè)TAM的標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果顯示MAO-A缺陷小鼠表現(xiàn)出更少的免疫抑制表型，即免疫抑制標(biāo)志物CD206表達(dá)顯著下調(diào)，而免疫刺激分子CD9，CD86和MHC class II I-Ab的表達(dá)上調(diào)（圖1e-h）。進(jìn)一步的分析顯示，來自Maoa KO小鼠的TAMs免疫抑制相關(guān)基因表達(dá)水平降低，如Mrc1，Chi3l3和Arg1（圖1i），而免疫刺激相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，如Il6，Tnfα和Ccl2（圖1j）。作者對(duì)野生型和Maoa KO小鼠進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，分析了腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（TIIs）。結(jié)果顯示TIIs由六種細(xì)胞組成，即TAM/Mono, T cell, NK cell, B cell, DC and pDC（圖1k）。兩種小鼠細(xì)胞類別分布相似。而TAM/Mono亞群由5種細(xì)胞類別組成，即TAM_1, TAM_2, Mono_1, Mono_2 and Mono_3（圖1k）。與Maoa KO小鼠的TAMs免疫表型減少一致，與野生型相比，其TAM亞群中TAM_1（Mrc1^lowCd86^high）比TAM_2（Mrc1 ^highCd86 ^low）的比例下降（圖1l）。免疫相關(guān)基因表達(dá)表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)（圖1m-n）。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明MAO-A是參與調(diào)節(jié)TAM極化進(jìn)而調(diào)控抗腫瘤免疫的。

圖1 MAO-A缺陷小鼠顯示與TAM極化改變相關(guān)的腫瘤生長減少

2、MAO-A直接調(diào)節(jié)TAM極化并影響TAM相關(guān)的T細(xì)胞抗腫瘤活性

為了確定MAO-A是否直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，進(jìn)行一個(gè)骨髓（BM）轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，從Maoa WT或KO小鼠中獲得的BM細(xì)胞被連續(xù)轉(zhuǎn)移到BoyJ (CD45.1) WT受體小鼠中，然后該小鼠接受B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞接種（圖2a）。在本實(shí)驗(yàn)中，MAO-A缺乏的比較僅限于免疫細(xì)胞。結(jié)果顯示免疫細(xì)胞中MAO-A缺陷導(dǎo)致腫瘤生長抑制（圖2b-c），改變TAM極化（圖2d-f），增強(qiáng)腫瘤浸潤CD8+T細(xì)胞激活，表明MAO-A直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抗腫瘤活性，特別是TAM極化和T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。

為了進(jìn)一步研究MAO-A是否作為巨噬細(xì)胞自主因子直接調(diào)控TAM極化從而影響抗腫瘤免疫，進(jìn)行了巨噬細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移腫瘤實(shí)驗(yàn)。從Maoa WT和KO小鼠中獲取BM細(xì)胞，然后培養(yǎng)成骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages, BMDMs)。然后將這些Maoa WT或KO BMDMs與B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞混合，皮下注射到BoyJ WT受體小鼠中建立實(shí)體腫瘤（圖2g）。在本實(shí)驗(yàn)中，MAO-A缺乏的比較僅限于TAM細(xì)胞。在接受Maoa KO BMDMs小鼠中觀察到腫瘤生長抑制（圖2h-i），TAM免疫抑制markers下調(diào)（圖2j），免疫刺激markers上調(diào)（圖2k-l），以及增強(qiáng)腫瘤浸潤CD8+T細(xì)胞激活（圖2m）。綜上所述，這些體內(nèi)研究表明MAO-A作為一種直接調(diào)節(jié)TAM極化的自主因子，從而影響T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)性和影響腫瘤生長。

圖2 MAO-A直接調(diào)節(jié)TAM極化并影響TAM相關(guān)的T細(xì)胞抗腫瘤活性

3、MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

為了研究MAO-A對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，體外培養(yǎng)Maoa WT和KO BMDMs，并通過添加抗炎刺激（IL4和IL-13）使這些巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型極化（圖3a）。觀察到，在M - CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化過程中，Maoa mRNA的表達(dá)在Maoa野生型BMDMs中有明顯的誘導(dǎo)作用，Maoa在成熟的BMDMs中表達(dá)趨于穩(wěn)定，并維持IL-4/ IL -13誘導(dǎo)的免疫抑制極化（圖3b-c）。Maoa KO BMDMs中MAO-A表達(dá)未檢測(cè)到，證實(shí)了其MAO-A缺失基因型（圖3b, d）。與野生型巨噬細(xì)胞相比，在IL-4/IL-13刺激下，Maoa KO巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更低的免疫抑制表型，這在其免疫抑制標(biāo)記物的表達(dá)減少中得到了證明（圖3e-g）。在巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中（圖3h），IL-4/ IL -13極化的Maoa KO巨噬細(xì)胞在抗CD3 /CD28刺激下，與免疫抑制表型的減弱一致，其對(duì)野生型CD8+ T細(xì)胞的抑制作用減弱（圖3i-k）。

為了驗(yàn)證MAO-A缺乏是否直接有助于減輕Maoa KO巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化，進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建MIG-Maoa逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，利用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Maoa KO BMDMs，并在這些巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了MAO-A的過表達(dá)（圖3l-n）。MAO-A過表達(dá)顯著加劇了IL-4/ IL-13刺激的Maoa KO BMDMs的免疫抑制表型（圖3o-p）。綜上所述，這些結(jié)果表明，MAO-A作為一種自主因子，在抗炎刺激下促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。

圖3 MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

4、MAO-A通過ROS上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

接下來，研究調(diào)控MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化的分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS；氧化應(yīng)激)會(huì)引起巨噬細(xì)胞的免疫抑制特征。MAO-A催化單胺的氧化脫氨，從而產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)作為副產(chǎn)物，可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平。因此，推測(cè)MAO-A可能通過上調(diào)TAM中的ROS水平，促進(jìn)TME中TAM的免疫抑制極化（圖4a）。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，測(cè)量了從攜帶B16-OVA腫瘤的Maoa WT和KO小鼠中分離的TAMs中的ROS水平，并檢測(cè)到Maoa KO TAMs中ROS水平顯著降低（圖4b-c）。對(duì)離體培養(yǎng)的Maoa野生型和KO BMMDs中ROS水平的測(cè)定也顯示，在IL-4/IL-13刺激或不刺激下，Maoa KO BMMDs中ROS水平降低，與體內(nèi)TAM結(jié)果一致（圖4d）。向IL-4/ IL-13刺激的Maoa WT和KO BMDMs補(bǔ)充H₂O₂可將其細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高到相似水平，并消除它們?cè)诿庖咭种茦?biāo)記物和特征基因表達(dá)的差異（圖4e-g）。另一方面，補(bǔ)充酪氨酸(MAO-A的底物)可增加ROS水平，并上調(diào)免疫抑制基因在Maoa WT BMDMs中的表達(dá)，但在Maoa KO BMDMs中不上調(diào)（圖4h-j）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化。

JAK-Stat6信號(hào)通路在介導(dǎo)IL-4/IL-13誘導(dǎo)TME中TAMs免疫抑制極化過程中起關(guān)鍵作用。IL-4/IL-13刺激后，JAK磷酸化，隨后Stat6磷酸化，磷酸化后的Stat6二聚并遷移至細(xì)胞核，然后與IL-4/IL-13相應(yīng)基因，包括那些參與巨噬細(xì)胞免疫響應(yīng)功能的基因的啟動(dòng)子結(jié)合。據(jù)報(bào)道ROS可以促進(jìn)JAK和Stat6磷酸化。因此，推測(cè)MAO-A可能通過上調(diào)ROS水平影響巨噬細(xì)胞極化，從而使JAK-Stat6信號(hào)通路敏感。事實(shí)上，直接分析從B16-OVA荷瘤Maoa WT和Maoa KO小鼠中分離的TAMs證實(shí)，與野生型TAMs相比，MAO - A缺陷的TAMs顯示Stat6激活降低（圖4k-l）。進(jìn)一步分析IL-4/ IL-13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路，與在Maoa WT BMDMs中相比，在Maoa KO BMDMs中JAK-Stat6信號(hào)顯著下降，補(bǔ)充H2O2可使其JAK-Stat6信號(hào)達(dá)到與WT類似水平（圖4m）。這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過ROS致敏的JAK-Stat6通路激活促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。

總之，這些體內(nèi)外數(shù)據(jù)支持MAO-A促進(jìn)TME中免疫抑制極化，通過上調(diào)TAM細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而提高IL-4/ IL -13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路。

圖4 MAO-A通過ROS上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

5、MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-小鼠腫瘤模型研究

MAO-A作為TAM免疫抑制極化的關(guān)鍵調(diào)控因子的鑒定使得MAO-A成為癌癥免疫治療的一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn)。由于已知的MAO-A在大腦中的功能，小分子MAOIs已經(jīng)被開發(fā)和臨床用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，使其成為一種高度可行和有吸引力的方法來重新利用這些已建立的MAOI藥物用于癌癥免疫治療。在體外IL-4/IL-13 誘導(dǎo)WT BMDM極化培養(yǎng)中（圖5a），添加多種MAOIs可以有效降低BMDM中的ROS水平，抑制它們的免疫抑制極化和基因（圖5b-e）。值得注意的是，圖5a測(cè)試的MAOIs包括苯乙肼、克勞吉林、莫氯比胺和吡吲哚，涵蓋了已建立的MAOIs的主要類別，這些類別是基于它們對(duì)MAO-A是非選擇性的還是選擇性的，以及它們的作用是否可逆。在這些MAOIs中，苯乙肼 (phenelzine商品名:Nardil)在美國臨床可用。在接下來的研究中，以苯乙肼為代表，使用兩種同基因小鼠腫瘤模型:B16-OVA黑色素瘤模型和MC38結(jié)腸癌模型，研究MAOIs用于癌癥免疫治療的可能性。值得注意的是，苯乙肼是一種非選擇性不可逆的MAOI，可抑制MAO-A及其同工酶MAO-B。然而，由于小鼠巨噬細(xì)胞主要表達(dá)MAO-A，而不是MAO-B，因此在這些腫瘤模型中，苯乙肼治療主要通過抑制MAO-A來調(diào)節(jié)TAM重編程。

首先，研究苯乙肼在B16-OVA腫瘤預(yù)防模型中的治療潛力（圖5f）。苯乙肼能有效抑制B6 WT小鼠B16-OVA腫瘤的生長（圖5g-h）。當(dāng)使用氯膦酸脂質(zhì)體處理敲除小鼠TAM時(shí)，小鼠沒有觀察到腫瘤生長的差異（圖5g-h），這表明苯乙肼通過調(diào)節(jié)TAMs來抑制腫瘤生長。相應(yīng)地，從苯乙肼處理的小鼠中分離出的TAMs顯示出較低的免疫抑制表型，表現(xiàn)為其免疫抑制標(biāo)記物和特征基因的表達(dá)降低，而免疫刺激標(biāo)志物增加（圖5i-j）。在MC38腫瘤中得出類似結(jié)論。

接下來，評(píng)估苯乙肼聯(lián)合治療的潛力，特別是聯(lián)合其他ICB治療，如PD-1/PD-L1阻斷治療（圖5k）。盡管大多數(shù)ICB療法針對(duì)的是CD8+ T細(xì)胞，但這些細(xì)胞實(shí)際上受到TME中的TAMs的密切調(diào)控，使靶向TAMs成為免疫治療的另一種潛在途徑。在B16-OVA和MC38腫瘤模型中，苯乙肼治療顯著抑制了預(yù)先建立的實(shí)體腫瘤的進(jìn)展，其水平與抗PD -1治療相當(dāng)，重要的是，苯乙肼與抗PD-1聯(lián)合治療具有協(xié)同抑制腫瘤的療效（圖5l-o）?？偟膩碚f，這些小鼠腫瘤模型研究為MAOIs通過靶向TAM重編程從而增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的癌癥免疫治療潛力提供了證據(jù)。

圖5 MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-小鼠腫瘤模型研究

6、MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-人類TAM和臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性研究

為了探索MAO-A阻斷治療的翻譯潛力，首先研究了MAO-A對(duì)人巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。分析體外培養(yǎng)的免疫刺激M1樣和免疫抑制M2樣人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征。有趣的是，在所有檢測(cè)的免疫檢查點(diǎn)、免疫刺激和免疫抑制基因中，MAOA是M2樣單核來源巨噬細(xì)胞（MDMs）中表達(dá)水平最高的基因（圖6a），提示MAO-A可能在促進(jìn)人巨噬細(xì)胞免疫抑制極化中發(fā)揮作用。MDM培養(yǎng)的時(shí)間過程分析證實(shí)了巨噬細(xì)胞分化過程中MAO-A基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，并在IL-4/IL-13誘導(dǎo)的免疫抑制極化后進(jìn)一步上調(diào)（圖6b-d）。用苯乙肼阻斷MAO-A可顯著抑制IL-4/IL-13誘導(dǎo)的MDMs免疫抑制極化（圖6e-g）。綜上所述，這些體外數(shù)據(jù)表明MAO-A在人巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，特別是在其免疫抑制極化期間，并且MAO-A阻斷具有重新編程人巨噬細(xì)胞極化的潛力。

為了直接評(píng)價(jià)MAOIs是否能在體內(nèi)重編程人TAM的極化，建立了人腫瘤/TAM異種移植NSG小鼠模型。A375人黑色素瘤細(xì)胞與健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離的單核細(xì)胞混合，注射到NSG小鼠中形成實(shí)體瘤，接種后給予或不給予苯乙肼治療（圖6h）。苯乙肼能有效抑制人TAMs的免疫抑制極化（圖6i-j）。

接下來，研究了MAOI誘導(dǎo)的人TAM重編程是否會(huì)影響人T細(xì)胞的抗腫瘤活性，使用3D人腫瘤/TAM/ T細(xì)胞類器官培養(yǎng)。NY-ESO-1是一種公認(rèn)的腫瘤抗原，通常在多種人類腫瘤中表達(dá)，被選為模型腫瘤抗原。A375人黑素瘤細(xì)胞系設(shè)計(jì)為共表達(dá)NY-ESO-1及其匹配的MHC分子HLA-A2作為人腫瘤靶點(diǎn)（命名為A375-A2-ESO）。NY-ESO-1特異性人CD8⁺T細(xì)胞的構(gòu)建是通過將Retro/ESO-TCR編碼NY-ESO-1特異性TCR（命名為ESO-TCR）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至健康供體外周血CD8⁺T細(xì)胞，將該細(xì)胞命名為ESO-T細(xì)胞，它表達(dá)ESO-TCRs，特異性靶向A375-A2-ESO腫瘤細(xì)胞，從而建立腫瘤特異性人CD8+ T細(xì)胞模型。將A375-A2-ESO人黑色素瘤細(xì)胞、ESO-T細(xì)胞和IL-4/IL-13極化的MDMs以2:2:1的比例混合，放置在模擬TME的3D腫瘤類器官培養(yǎng)物中（圖6k）。IL-4/IL-13極化MDMs有效抑制ESO - T細(xì)胞介導(dǎo)的A375-A2-ESO腫瘤細(xì)胞的殺傷；在MDM極化過程中，苯乙肼的治療在很大程度上緩解了這種免疫抑制作用（圖6l）。因此，與苯乙肼處理的MDMs共培養(yǎng)的ESO-T細(xì)胞相比，與非苯肼處理的MDMs共培養(yǎng)的ESO-T細(xì)胞顯示了T細(xì)胞活化的增強(qiáng)（圖6m）。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明MAOI誘導(dǎo)的人類TAM重編程具有改善抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的潛力。此外，人和小鼠的TAM都高表達(dá)MAOA基因（圖6n），證實(shí)MAO-A可作為人類TAMs的有效藥物靶點(diǎn)。

最后，分析了MAOA基因表達(dá)水平與幾種癌癥病人臨床預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示瘤內(nèi)MAOA基因與卵巢癌，淋巴癌和乳腺癌患者的臨床總生存率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖6o-q）。此外，黑色素瘤患者腫瘤內(nèi)高水平的MAOA表達(dá)很大程度上抵消了PD-1治療提供的生存好處，提示MAO-A阻斷治療與PD-1/PD-L1阻斷治療聯(lián)合可能通過調(diào)節(jié)TAM極化，從而改變免疫抑制TME，提高抗腫瘤免疫能力，提供協(xié)同治療好處（圖6r）。

綜上所述，人類TAM和臨床相關(guān)性研究證實(shí)了MAO-A作為人類TAM中一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn)，并支持了MAO-A通過靶向TAM重編程阻斷癌癥免疫治療的翻譯潛力。

圖6 MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-人類TAM和臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性研究

參考文獻(xiàn)：

Wang Yu-Chen., Wang Xi., Yu Jiaji., Ma Feiyang., Li Zhe., Zhou Yang., Zeng Samuel., Ma Xiaoya., Li Yan-Ruide., Neal Adam., Huang Jie., To Angela., Clarke Nicole., Memarzadeh Sanaz., Pellegrini Matteo., Yang Lili.(2021). Targeting monoamine oxidase A-regulated tumor-associated macrophage polarization for cancer immunotherapy. Nat Commun, 12(1), 3530. doi:10.1038/s41467-021-23164-2