靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是一種很有前途的策略,可以改變免疫抑制腫瘤微環(huán)境,改善腫瘤免疫治療。單胺氧化酶A (MAO-A)是一種因其在大腦中的功能而著名的酶,小分子MAO抑制劑(MAOIs)用于臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這里作者發(fā)現(xiàn)MAO-A誘導(dǎo)人和小鼠的TAMs進(jìn)而可用于癌癥的免疫治療。該文2021年6月發(fā)表于《nature communications》IF:14.919期刊上。
技術(shù)路線:
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1、MAO-A缺陷小鼠顯示與TAM極化改變相關(guān)的腫瘤生長(zhǎng)減少
將同基因B16-OVA黑色素瘤接種給C57BL/6J小鼠,分離出TAM并評(píng)估TAM基因表達(dá)譜。除了參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的經(jīng)典基因的變化,還觀察到一個(gè)Maoa基因在TAMs中的上調(diào)表達(dá)(圖1a),這表明MAO-A可能參與了TAM活性的調(diào)節(jié)。首先構(gòu)建MAO-A缺陷的小鼠,然后接種B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞,結(jié)果顯示,與野生型相比,MAO-A缺陷小鼠的腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制(圖1b-d)。流式檢測(cè)TAM的標(biāo)志物表達(dá),結(jié)果顯示MAO-A缺陷小鼠表現(xiàn)出更少的免疫抑制表型,即免疫抑制標(biāo)志物CD206表達(dá)顯著下調(diào),而免疫刺激分子CD9,CD86和MHC class II I-Ab的表達(dá)上調(diào)(圖1e-h)。進(jìn)一步的分析顯示,來(lái)自Maoa KO小鼠的TAMs免疫抑制相關(guān)基因表達(dá)水平降低,如Mrc1,Chi3l3和Arg1(圖1i),而免疫刺激相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),如Il6,Tnfα和Ccl2(圖1j)。作者對(duì)野生型和Maoa KO小鼠進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,分析了腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞(TIIs)。結(jié)果顯示TIIs由六種細(xì)胞組成,即TAM/Mono, T cell, NK cell, B cell, DC and pDC(圖1k)。兩種小鼠細(xì)胞類(lèi)別分布相似。而TAM/Mono亞群由5種細(xì)胞類(lèi)別組成,即TAM_1, TAM_2, Mono_1, Mono_2 and Mono_3(圖1k)。與Maoa KO小鼠的TAMs免疫表型減少一致,與野生型相比,其TAM亞群中TAM_1(Mrc1lowCd86high)比TAM_2(Mrc1 highCd86 low)的比例下降(圖1l)。免疫相關(guān)基因表達(dá)表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)(圖1m-n)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明MAO-A是參與調(diào)節(jié)TAM極化進(jìn)而調(diào)控抗腫瘤免疫的。
圖1 MAO-A缺陷小鼠顯示與TAM極化改變相關(guān)的腫瘤生長(zhǎng)減少
2、MAO-A直接調(diào)節(jié)TAM極化并影響TAM相關(guān)的T細(xì)胞抗腫瘤活性
為了確定MAO-A是否直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,進(jìn)行一個(gè)骨髓(BM)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),從Maoa WT或KO小鼠中獲得的BM細(xì)胞被連續(xù)轉(zhuǎn)移到BoyJ (CD45.1) WT受體小鼠中,然后該小鼠接受B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞接種(圖2a)。在本實(shí)驗(yàn)中,MAO-A缺乏的比較僅限于免疫細(xì)胞。結(jié)果顯示免疫細(xì)胞中MAO-A缺陷導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖2b-c),改變TAM極化(圖2d-f),增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)CD8+T細(xì)胞激活,表明MAO-A直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抗腫瘤活性,特別是TAM極化和T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)。
為了進(jìn)一步研究MAO-A是否作為巨噬細(xì)胞自主因子直接調(diào)控TAM極化從而影響抗腫瘤免疫,進(jìn)行了巨噬細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移腫瘤實(shí)驗(yàn)。從Maoa WT和KO小鼠中獲取BM細(xì)胞,然后培養(yǎng)成骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages, BMDMs)。然后將這些Maoa WT或KO BMDMs與B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞混合,皮下注射到BoyJ WT受體小鼠中建立實(shí)體腫瘤(圖2g)。在本實(shí)驗(yàn)中,MAO-A缺乏的比較僅限于TAM細(xì)胞。在接受Maoa KO BMDMs小鼠中觀察到腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖2h-i),TAM免疫抑制markers下調(diào)(圖2j),免疫刺激markers上調(diào)(圖2k-l),以及增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)CD8+T細(xì)胞激活(圖2m)。綜上所述,這些體內(nèi)研究表明MAO-A作為一種直接調(diào)節(jié)TAM極化的自主因子,從而影響T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)性和影響腫瘤生長(zhǎng)。
圖2 MAO-A直接調(diào)節(jié)TAM極化并影響TAM相關(guān)的T細(xì)胞抗腫瘤活性
3、MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化
為了研究MAO-A對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控,體外培養(yǎng)Maoa WT和KO BMDMs,并通過(guò)添加抗炎刺激(IL4和IL-13)使這些巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型極化(圖3a)。觀察到,在M - CSF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中,Maoa mRNA的表達(dá)在Maoa野生型BMDMs中有明顯的誘導(dǎo)作用,Maoa在成熟的BMDMs中表達(dá)趨于穩(wěn)定,并維持IL-4/ IL -13誘導(dǎo)的免疫抑制極化(圖3b-c)。Maoa KO BMDMs中MAO-A表達(dá)未檢測(cè)到,證實(shí)了其MAO-A缺失基因型(圖3b, d)。與野生型巨噬細(xì)胞相比,在IL-4/IL-13刺激下,Maoa KO巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更低的免疫抑制表型,這在其免疫抑制標(biāo)記物的表達(dá)減少中得到了證明(圖3e-g)。在巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中(圖3h),IL-4/ IL -13極化的Maoa KO巨噬細(xì)胞在抗CD3 /CD28刺激下,與免疫抑制表型的減弱一致,其對(duì)野生型CD8+ T細(xì)胞的抑制作用減弱(圖3i-k)。
為了驗(yàn)證MAO-A缺乏是否直接有助于減輕Maoa KO巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化,進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建MIG-Maoa逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,利用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Maoa KO BMDMs,并在這些巨噬細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了MAO-A的過(guò)表達(dá)(圖3l-n)。MAO-A過(guò)表達(dá)顯著加劇了IL-4/ IL-13刺激的Maoa KO BMDMs的免疫抑制表型(圖3o-p)。綜上所述,這些結(jié)果表明,MAO-A作為一種自主因子,在抗炎刺激下促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。
圖3 MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化
4、MAO-A通過(guò)ROS上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化
接下來(lái),研究調(diào)控MAO-A促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化的分子機(jī)制。據(jù)報(bào)道,細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS;氧化應(yīng)激)會(huì)引起巨噬細(xì)胞的免疫抑制特征。MAO-A催化單胺的氧化脫氨,從而產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)作為副產(chǎn)物,可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平。因此,推測(cè)MAO-A可能通過(guò)上調(diào)TAM中的ROS水平,促進(jìn)TME中TAM的免疫抑制極化(圖4a)。為了驗(yàn)證這一假設(shè),測(cè)量了從攜帶B16-OVA腫瘤的Maoa WT和KO小鼠中分離的TAMs中的ROS水平,并檢測(cè)到Maoa KO TAMs中ROS水平顯著降低(圖4b-c)。對(duì)離體培養(yǎng)的Maoa野生型和KO BMMDs中ROS水平的測(cè)定也顯示,在IL-4/IL-13刺激或不刺激下,Maoa KO BMMDs中ROS水平降低,與體內(nèi)TAM結(jié)果一致(圖4d)。向IL-4/ IL-13刺激的Maoa WT和KO BMDMs補(bǔ)充H2O2可將其細(xì)胞內(nèi)ROS水平提高到相似水平,并消除它們?cè)诿庖咭种茦?biāo)記物和特征基因表達(dá)的差異(圖4e-g)。另一方面,補(bǔ)充酪氨酸(MAO-A的底物)可增加ROS水平,并上調(diào)免疫抑制基因在Maoa WT BMDMs中的表達(dá),但在Maoa KO BMDMs中不上調(diào)(圖4h-j)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫抑制極化。
JAK-Stat6信號(hào)通路在介導(dǎo)IL-4/IL-13誘導(dǎo)TME中TAMs免疫抑制極化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。IL-4/IL-13刺激后,JAK磷酸化,隨后Stat6磷酸化,磷酸化后的Stat6二聚并遷移至細(xì)胞核,然后與IL-4/IL-13相應(yīng)基因,包括那些參與巨噬細(xì)胞免疫響應(yīng)功能的基因的啟動(dòng)子結(jié)合。據(jù)報(bào)道ROS可以促進(jìn)JAK和Stat6磷酸化。因此,推測(cè)MAO-A可能通過(guò)上調(diào)ROS水平影響巨噬細(xì)胞極化,從而使JAK-Stat6信號(hào)通路敏感。事實(shí)上,直接分析從B16-OVA荷瘤Maoa WT和Maoa KO小鼠中分離的TAMs證實(shí),與野生型TAMs相比,MAO - A缺陷的TAMs顯示Stat6激活降低(圖4k-l)。進(jìn)一步分析IL-4/ IL-13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路,與在Maoa WT BMDMs中相比,在Maoa KO BMDMs中JAK-Stat6信號(hào)顯著下降,補(bǔ)充H2O2可使其JAK-Stat6信號(hào)達(dá)到與WT類(lèi)似水平(圖4m)。這些數(shù)據(jù)表明MAO-A通過(guò)ROS致敏的JAK-Stat6通路激活促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。
總之,這些體內(nèi)外數(shù)據(jù)支持MAO-A促進(jìn)TME中免疫抑制極化,通過(guò)上調(diào)TAM細(xì)胞內(nèi)ROS水平,從而提高IL-4/ IL -13誘導(dǎo)的JAK-Stat6信號(hào)通路。
圖4 MAO-A通過(guò)ROS上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化
5、MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-小鼠腫瘤模型研究
MAO-A作為TAM免疫抑制極化的關(guān)鍵調(diào)控因子的鑒定使得MAO-A成為癌癥免疫治療的一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn)。由于已知的MAO-A在大腦中的功能,小分子MAOIs已經(jīng)被開(kāi)發(fā)和臨床用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,使其成為一種高度可行和有吸引力的方法來(lái)重新利用這些已建立的MAOI藥物用于癌癥免疫治療。在體外IL-4/IL-13 誘導(dǎo)WT BMDM極化培養(yǎng)中(圖5a),添加多種MAOIs可以有效降低BMDM中的ROS水平,抑制它們的免疫抑制極化和基因(圖5b-e)。值得注意的是,圖5a測(cè)試的MAOIs包括苯乙肼、克勞吉林、莫氯比胺和吡吲哚,涵蓋了已建立的MAOIs的主要類(lèi)別,這些類(lèi)別是基于它們對(duì)MAO-A是非選擇性的還是選擇性的,以及它們的作用是否可逆。在這些MAOIs中,苯乙肼 (phenelzine商品名:Nardil)在美國(guó)臨床可用。在接下來(lái)的研究中,以苯乙肼為代表,使用兩種同基因小鼠腫瘤模型:B16-OVA黑色素瘤模型和MC38結(jié)腸癌模型,研究MAOIs用于癌癥免疫治療的可能性。值得注意的是,苯乙肼是一種非選擇性不可逆的MAOI,可抑制MAO-A及其同工酶MAO-B。然而,由于小鼠巨噬細(xì)胞主要表達(dá)MAO-A,而不是MAO-B,因此在這些腫瘤模型中,苯乙肼治療主要通過(guò)抑制MAO-A來(lái)調(diào)節(jié)TAM重編程。
首先,研究苯乙肼在B16-OVA腫瘤預(yù)防模型中的治療潛力(圖5f)。苯乙肼能有效抑制B6 WT小鼠B16-OVA腫瘤的生長(zhǎng)(圖5g-h)。當(dāng)使用氯膦酸脂質(zhì)體處理敲除小鼠TAM時(shí),小鼠沒(méi)有觀察到腫瘤生長(zhǎng)的差異(圖5g-h),這表明苯乙肼通過(guò)調(diào)節(jié)TAMs來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。相應(yīng)地,從苯乙肼處理的小鼠中分離出的TAMs顯示出較低的免疫抑制表型,表現(xiàn)為其免疫抑制標(biāo)記物和特征基因的表達(dá)降低,而免疫刺激標(biāo)志物增加(圖5i-j)。在MC38腫瘤中得出類(lèi)似結(jié)論。
接下來(lái),評(píng)估苯乙肼聯(lián)合治療的潛力,特別是聯(lián)合其他ICB治療,如PD-1/PD-L1阻斷治療(圖5k)。盡管大多數(shù)ICB療法針對(duì)的是CD8+ T細(xì)胞,但這些細(xì)胞實(shí)際上受到TME中的TAMs的密切調(diào)控,使靶向TAMs成為免疫治療的另一種潛在途徑。在B16-OVA和MC38腫瘤模型中,苯乙肼治療顯著抑制了預(yù)先建立的實(shí)體腫瘤的進(jìn)展,其水平與抗PD -1治療相當(dāng),重要的是,苯乙肼與抗PD-1聯(lián)合治療具有協(xié)同抑制腫瘤的療效(圖5l-o)??偟膩?lái)說(shuō),這些小鼠腫瘤模型研究為MAOIs通過(guò)靶向TAM重編程從而增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的癌癥免疫治療潛力提供了證據(jù)。
圖5 MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-小鼠腫瘤模型研究
6、MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-人類(lèi)TAM和臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性研究
為了探索MAO-A阻斷治療的翻譯潛力,首先研究了MAO-A對(duì)人巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。分析體外培養(yǎng)的免疫刺激M1樣和免疫抑制M2樣人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征。有趣的是,在所有檢測(cè)的免疫檢查點(diǎn)、免疫刺激和免疫抑制基因中,MAOA是M2樣單核來(lái)源巨噬細(xì)胞(MDMs)中表達(dá)水平最高的基因(圖6a),提示MAO-A可能在促進(jìn)人巨噬細(xì)胞免疫抑制極化中發(fā)揮作用。MDM培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)程分析證實(shí)了巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中MAO-A基因和蛋白表達(dá)上調(diào),并在IL-4/IL-13誘導(dǎo)的免疫抑制極化后進(jìn)一步上調(diào)(圖6b-d)。用苯乙肼阻斷MAO-A可顯著抑制IL-4/IL-13誘導(dǎo)的MDMs免疫抑制極化(圖6e-g)。綜上所述,這些體外數(shù)據(jù)表明MAO-A在人巨噬細(xì)胞中高表達(dá),特別是在其免疫抑制極化期間,并且MAO-A阻斷具有重新編程人巨噬細(xì)胞極化的潛力。
為了直接評(píng)價(jià)MAOIs是否能在體內(nèi)重編程人TAM的極化,建立了人腫瘤/TAM異種移植NSG小鼠模型。A375人黑色素瘤細(xì)胞與健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)分離的單核細(xì)胞混合,注射到NSG小鼠中形成實(shí)體瘤,接種后給予或不給予苯乙肼治療(圖6h)。苯乙肼能有效抑制人TAMs的免疫抑制極化(圖6i-j)。
接下來(lái),研究了MAOI誘導(dǎo)的人TAM重編程是否會(huì)影響人T細(xì)胞的抗腫瘤活性,使用3D人腫瘤/TAM/ T細(xì)胞類(lèi)器官培養(yǎng)。NY-ESO-1是一種公認(rèn)的腫瘤抗原,通常在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá),被選為模型腫瘤抗原。A375人黑素瘤細(xì)胞系設(shè)計(jì)為共表達(dá)NY-ESO-1及其匹配的MHC分子HLA-A2作為人腫瘤靶點(diǎn)(命名為A375-A2-ESO)。NY-ESO-1特異性人CD8+T細(xì)胞的構(gòu)建是通過(guò)將Retro/ESO-TCR編碼NY-ESO-1特異性TCR(命名為ESO-TCR)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至健康供體外周血CD8+T細(xì)胞,將該細(xì)胞命名為ESO-T細(xì)胞,它表達(dá)ESO-TCRs,特異性靶向A375-A2-ESO腫瘤細(xì)胞,從而建立腫瘤特異性人CD8+ T細(xì)胞模型。將A375-A2-ESO人黑色素瘤細(xì)胞、ESO-T細(xì)胞和IL-4/IL-13極化的MDMs以2:2:1的比例混合,放置在模擬TME的3D腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)物中(圖6k)。IL-4/IL-13極化MDMs有效抑制ESO - T細(xì)胞介導(dǎo)的A375-A2-ESO腫瘤細(xì)胞的殺傷;在MDM極化過(guò)程中,苯乙肼的治療在很大程度上緩解了這種免疫抑制作用(圖6l)。因此,與苯乙肼處理的MDMs共培養(yǎng)的ESO-T細(xì)胞相比,與非苯肼處理的MDMs共培養(yǎng)的ESO-T細(xì)胞顯示了T細(xì)胞活化的增強(qiáng)(圖6m)。總的來(lái)說(shuō),這些數(shù)據(jù)表明MAOI誘導(dǎo)的人類(lèi)TAM重編程具有改善抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的潛力。此外,人和小鼠的TAM都高表達(dá)MAOA基因(圖6n),證實(shí)MAO-A可作為人類(lèi)TAMs的有效藥物靶點(diǎn)。
最后,分析了MAOA基因表達(dá)水平與幾種癌癥病人臨床預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示瘤內(nèi)MAOA基因與卵巢癌,淋巴癌和乳腺癌患者的臨床總生存率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖6o-q)。此外,黑色素瘤患者腫瘤內(nèi)高水平的MAOA表達(dá)很大程度上抵消了PD-1治療提供的生存好處,提示MAO-A阻斷治療與PD-1/PD-L1阻斷治療聯(lián)合可能通過(guò)調(diào)節(jié)TAM極化,從而改變免疫抑制TME,提高抗腫瘤免疫能力,提供協(xié)同治療好處(圖6r)。
綜上所述,人類(lèi)TAM和臨床相關(guān)性研究證實(shí)了MAO-A作為人類(lèi)TAM中一個(gè)有前途的藥物靶點(diǎn),并支持了MAO-A通過(guò)靶向TAM重編程阻斷癌癥免疫治療的翻譯潛力。
圖6 MAO-A阻斷腫瘤免疫治療-人類(lèi)TAM和臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性研究
參考文獻(xiàn):
Wang Yu-Chen., Wang Xi., Yu Jiaji., Ma Feiyang., Li Zhe., Zhou Yang., Zeng Samuel., Ma Xiaoya., Li Yan-Ruide., Neal Adam., Huang Jie., To Angela., Clarke Nicole., Memarzadeh Sanaz., Pellegrini Matteo., Yang Lili.(2021). Targeting monoamine oxidase A-regulated tumor-associated macrophage polarization for cancer immunotherapy. Nat Commun, 12(1), 3530. doi:10.1038/s41467-021-23164-2