lncRNA在NPM1突變的急性髓系白血病事件中的罪證

核磷蛋白(Nucleophosmin，NPM1)是急性髓系白血病(AML)中最常見(jiàn)的突變基因，會(huì)導(dǎo)致編碼的核仁蛋白(NPM1c⁺)發(fā)生異常胞漿易位。NPM1c ⁺維持一個(gè)獨(dú)特的白血病基因表達(dá)程序，以激活HOXA/B簇和MEIS1癌基因?yàn)樘卣?，促進(jìn)白血病發(fā)生。然而，NPM1c⁺控制這種基因表達(dá)模式促進(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制仍在很大程度上未知。本文揭示了HOXBLINC lncRNA激活在NPM1c ⁺白血病中扮演促癌作用。HOXBLINC和其合作者MLL1是NPM1c⁺ AML的潛在治療靶點(diǎn)。本文于2021年3月發(fā)表在《Nature Communications》IF:14.919。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調(diào)

HOX基因，特別是HOXA和HOXB聚類基因的上調(diào)不僅是AML發(fā)病的特點(diǎn)，也是其主要機(jī)制。HoxBlinc lncRNA已經(jīng)被證明是在發(fā)育過(guò)程中激活前HoxB基因轉(zhuǎn)錄所必需的。為了確定HOXBLINC是否與HOXB基因一起在AML中異常表達(dá)，檢測(cè)了正常BMMNC細(xì)胞和CD34+陽(yáng)性細(xì)胞，以及NPM1c ⁺AML病人中HOXBLINC lncRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺AML病人中顯著高表達(dá)，在TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)一樣的結(jié)果（圖1A-B）。表明HOXBLINC lncRNA在NPM1c ⁺白血病中特異性上調(diào)。

2、HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生

隨后鑒定了NPM1c ⁺AML和NPM1c ^WTAML病人中的差異表達(dá)基因，與WT相比，有871個(gè)下調(diào)基因和980個(gè)上調(diào)基因，包括HoxBlinc和NPM1c+的特征基因HoxB2-5，HoxA7,9-11，Meis1，Runx1（圖1c）。然后，通過(guò)RNA-seq分析比較了對(duì)照組和HOXBLINCi細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄組變化。一致地，NPM1c+細(xì)胞表現(xiàn)出HOXBLINC lncRNA和常見(jiàn)的NPM1c+ AML標(biāo)記基因的高表達(dá)(圖1d)。有趣的是，在OCI-AML3細(xì)胞中抑制HOXBLINC顯著抑制了許多NPM1c+標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄，如HOXB2-5、HOXA9-11、RUNX1和MEIS1(圖1d)。GSEA和GO分析顯示，HOXBLINC的缺失會(huì)影響NPM1突變、HOXA9通路、癌癥、細(xì)胞周期、細(xì)胞命運(yùn)、髓樣細(xì)胞分化以及Wnt和JAK-STAT信號(hào)通路中涉及AML的通路和基因（圖1e-f）。此外，與對(duì)照組相比，HOXBLINC KD顯著抑制OCI-AML3細(xì)胞增殖（圖1g）。當(dāng)把Dox誘導(dǎo)的HOXBLINC KD OCI-AML3克隆移植到NOD-scid IL2Rγnull (NSG)小鼠，然后進(jìn)行Dox誘導(dǎo)或?qū)φ仗幚頃r(shí)，與未接受Dox處理的小鼠相比，Dox處理的受體小鼠的生存期顯著延長(zhǎng)（圖1h）。并且HOXBLINC KD顯著增加了小鼠預(yù)后，以及腫瘤病理改變（圖1i-j）。因此，HOXBLINCKD降低了腫瘤負(fù)擔(dān)，并減弱了體內(nèi)白血病進(jìn)展，這可能是NPM1c+ AML患者的特異性。

圖1 HOXBLINC在NPM1c+ AML患者中被激活，HOXBLINC的缺失擾亂了NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生

3、HoxBlinc在造血中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致小鼠的AML樣致死疾病

已有研究表明，小鼠造血干細(xì)胞(HSCs)中人源化NPM1c+敲入等位基因(NPM1c/+)的激活會(huì)導(dǎo)致Hox基因過(guò)度表達(dá)、增強(qiáng)self-real和骨髓增生擴(kuò)大，以及遲發(fā)性AML的發(fā)展。由于NPM1c+激活HOXBLINC，而HOXBLINC對(duì)NPM1c+介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序和白血病發(fā)生至關(guān)重要，因此確定HOXBLINC的激活是否足以導(dǎo)致異常造血和類似于NPM1c/+小鼠的髓系惡性腫瘤非常重要。HoxBlinc在長(zhǎng)期(LT)和短期(ST)造血干細(xì)胞中表達(dá)高，在祖細(xì)胞(MPP, CMP和GMP)中表達(dá)降低，除了B220+ B細(xì)胞，在成熟細(xì)胞系中進(jìn)一步降低（圖2a）。HoxBlinc在造血中的表達(dá)模式提示該lncRNA可能在調(diào)控HSPC功能中發(fā)揮重要作用。為了研究HoxBlinc活化對(duì)體內(nèi)正常造血和白血病發(fā)生的影響，構(gòu)建了HoxBlinc轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型，在Vav1啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(HS321/45-vav載體)的控制下，將全長(zhǎng)小鼠HoxBlinc cDNA插入小鼠基因組，以確保轉(zhuǎn)基因在造血系統(tǒng)中的特異性表達(dá)(圖2b)。獲得2只HoxBlincTg小鼠。將該轉(zhuǎn)基因插入到Tg第1系18q染色體上Bin1基因的內(nèi)含子中(圖2c)。BM細(xì)胞中HoxBlinc RNA的表達(dá)水平分別是Tg Line #1和#2內(nèi)源性HoxBlinc表達(dá)水平的18倍和3倍(圖2d)。

對(duì)HoxBlincTg (Line #1)小鼠隊(duì)列的監(jiān)測(cè)顯示，1歲以內(nèi)，67%的HoxBlincTg小鼠(15只中有10只)因病死或被殺，而WT小鼠(n = 12只)沒(méi)有死亡（圖2e）。與野生型相比，垂死的HoxBlincTg小鼠表現(xiàn)出體重減輕、肝脾腫大、淋巴結(jié)腫大以及腳墊和股骨蒼白（圖2f）。形態(tài)學(xué)上，May-Grünwald-Giemsa染色顯示母細(xì)胞明顯增加(圖2g，左)。BM細(xì)胞自旋制備也顯示髓系細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，未成熟髓系前體增多(圖2g，右側(cè))。骨髓組織切片的形態(tài)學(xué)評(píng)估顯示髓樣增生伴未成熟髓樣前體增多，以髓過(guò)氧化物酶(MPO)陽(yáng)性表明髓樣來(lái)源（圖2h）。此外，HoxBlincTg的組織學(xué)評(píng)估顯示脾臟、肝臟和淋巴結(jié)切片正常器官結(jié)構(gòu)扭曲，并有MPO陽(yáng)性骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2h-i）。這些數(shù)據(jù)表明，與NPM1c/+小鼠相似，HoxBlinc過(guò)表達(dá)小鼠足以引起類似AML的異常血液學(xué)特征。

圖2 HoxBlinc轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)小鼠導(dǎo)致致死性AML

4、HoxBlinc基因表達(dá)增強(qiáng)HSC自我更新，擴(kuò)大骨髓形成

NPM1c+促進(jìn)HSC自我更新和髓細(xì)胞擴(kuò)張的能力已被明確。為了進(jìn)一步了解HoxBlinc在AML發(fā)病機(jī)制中的作用，研究了HoxBlinc過(guò)表達(dá)對(duì)HSPC功能的影響。HoxBlincTg BM細(xì)胞中Lin^- scale-1⁺c-Kit⁺ (LSK)細(xì)胞的比例明顯高于野生型小鼠，而Lin^- scale-1^- c-Kit⁺ (LK)細(xì)胞群與野生型小鼠相似（圖3a）。計(jì)算ST-HSCs LT-HSCs總數(shù)時(shí)，股骨和多能祖細(xì)胞(MMP)計(jì)算基于比例LSK內(nèi)細(xì)胞群和BM多孔性，LT-和ST-HSCs池，但不是MPP明顯擴(kuò)大，盡管只有ST-HSCs LSK內(nèi)細(xì)胞的比例增加（圖3b）。當(dāng)對(duì)LK細(xì)胞內(nèi)的每個(gè)髓系祖細(xì)胞群進(jìn)行分析時(shí)，HoxBlincTg小鼠中GMP的百分比顯著高于WT小鼠，但MEP/CMP細(xì)胞群的百分比低于WT小鼠（圖3c）。因此，HoxBlinc過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HSPC池失調(diào)，導(dǎo)致體內(nèi)造血系統(tǒng)向髓系傾斜。

接下來(lái)，通過(guò)體外復(fù)制、配對(duì)子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)移植研究了HoxBlinc過(guò)表達(dá)對(duì)造血干細(xì)胞自我更新和再生能力的影響。在HoxBlincTg LSK細(xì)胞中，連續(xù)4輪的復(fù)制電位均顯著高于WT細(xì)胞(圖3d)。使用WT和HoxBlincTg原始CD34?LSK細(xì)胞的配對(duì)子細(xì)胞檢測(cè)顯示，具有對(duì)稱自我更新能力的HoxBlincTg CD34?LSK細(xì)胞比例更高，而進(jìn)行對(duì)稱分化或不對(duì)稱自我更新的細(xì)胞比WT減少（圖3e）。競(jìng)爭(zhēng)移植實(shí)驗(yàn)表明，HoxBlincTg BM細(xì)胞移植后，受體外周血中供體細(xì)胞(CD45.2+)嵌合率穩(wěn)定上升，移植7個(gè)月后達(dá)到~80%，而WT BM細(xì)胞移植后小鼠外周血中CD45.2+細(xì)胞群保持在~50%（圖3f）。有趣的是，接受HoxBlincTg BM細(xì)胞的小鼠在移植后2.5-7個(gè)月死亡率更高(圖3g)?？傮w而言，HoxBlinc基因在小鼠中的表達(dá)增強(qiáng)了HSC的自我更新，并擴(kuò)大了骨髓形成，導(dǎo)致AML樣疾病，與NPM1c/+小鼠中看到的表型相似。

圖3 HoxBlinc轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強(qiáng)HSC自我更新，擴(kuò)大骨髓形成

5、HoxBlinc的過(guò)表達(dá)通過(guò)提高HSPC⁺中增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性激活NPM1c+標(biāo)記基因

為了進(jìn)一步確定HOXBLINC是否是NPM1c+的下游介質(zhì)，以維持HSPC中NPM1c+標(biāo)記基因的激活，對(duì)8周齡小鼠的WT和HoxBlincTg LSK細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq，總計(jì)鑒定到1281個(gè)差異表達(dá)基因（圖4a）。其中，上調(diào)的有718個(gè)，下調(diào)的有563個(gè)。值得注意的是，在NPM1c/⁺ vs . WT LSK細(xì)胞中，27.3%的上調(diào)基因和21%的下調(diào)基因基因重疊（圖4b）。GSEA分析HoxBlincTgv s. WT LSK細(xì)胞差異表達(dá)基因揭示了與NPM1c / +與WT LSK細(xì)胞相似的轉(zhuǎn)錄特征和富集通路，包括NPM1-mutated特征，HOXA9致癌途徑，HSC增殖，細(xì)胞命運(yùn)的承諾，骨髓分化，Wnt和JAK-STAT信號(hào)通路（圖4c-d）。

由于HoxBlinc通過(guò)招募SETD1A和MLL1復(fù)合物，并在HoxB前位點(diǎn)組織活躍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)HoxB前基因的表達(dá)，NPM1c+或HoxBlincTg引起的HoxBlinc上調(diào)可以通過(guò)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性來(lái)激活其在HSPC中的靶基因。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，使用WT、NPM1c/+和HoxBlincTg小鼠的LSK細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析高通量測(cè)序 (ATAC-seq)。巧合的是，NPM1c/+和HoxBlincTg LSK細(xì)胞有相當(dāng)一部分基因表現(xiàn)出啟動(dòng)子可及性的增加(28.9%)或減少(24.3%)（圖4e）。此外，NPM1c+或HoxBlincTg使啟動(dòng)子可及性增加的基因中有相當(dāng)一部分也上調(diào)，這些基因包括NPM1c特征基因HoxB2-5、HoxA9-10、Meis1和Runx1，以及其他靶基因如Stat1和Cdr2（圖4f-g）。這些結(jié)果表明HoxBlinc lncRNA的過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)HSPC中增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性特異性激活NPM1c+標(biāo)記基因。

圖4 HoxBlinc過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)LSK細(xì)胞啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性激活NPM1c+標(biāo)記基因

6、HoxBlinc直接與靶基因結(jié)合，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

CTCF邊界促進(jìn)了受限拓?fù)湎嚓P(guān)域(TADs)內(nèi)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的相互作用。作者之前報(bào)道了后HOXA位點(diǎn)的CTCF邊界建立和維持活躍的TAD，以驅(qū)動(dòng)后HOXA基因表達(dá)。為了研究HoxBlinc過(guò)表達(dá)是否會(huì)影響CTCF定義的HoxB位點(diǎn)前TAD域和增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用高通量測(cè)序捕捉環(huán)狀染色體構(gòu)象(4C-seq) 使用HoxB位點(diǎn)CTCF結(jié)合位點(diǎn)(cbs)作為HoxBlincTg與WT Lin?c-Kit+細(xì)胞（圖5a）。有趣的是，HoxBlinc過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了這些由CBS5 /5和/或+43CBS介導(dǎo)的HoxB前位點(diǎn)內(nèi)的長(zhǎng)程相互作用（圖5b）。而+73Kb CBS (+73CBS)和HoxB13 CBS (CBS13)與前HoxB基因不互作，盡管+73CBS與CBS5/6和CBS8/9存在交互作用，但不受HoxBlinc過(guò)表達(dá)的影響（圖5b）。此外，HoxBlinc過(guò)表達(dá)也誘導(dǎo)了CBS4/5和/或+43CBS與HoxBlinc靶基因如Stat1、Crd2和后HoxA基因啟動(dòng)子區(qū)域的長(zhǎng)程相互作用，而非HoxBlinc靶基因HoxD（圖5c）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc與CBS4/5和+43CBS協(xié)調(diào)，促進(jìn)并維持與NPM1c+標(biāo)記基因位點(diǎn)的長(zhǎng)期染色質(zhì)相互作用，從而激活它們。

為了完全理解HoxBlinc過(guò)表達(dá)調(diào)控HSPC造血轉(zhuǎn)錄程序的機(jī)制，進(jìn)行了ChIRP-seq在WT和HoxBlincTg Lin ^- c-Kit⁺細(xì)胞中繪制基因組HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)。HoxBlinc的過(guò)表達(dá)顯著增加了其與HoxB前基因啟動(dòng)子區(qū)域和其他反式靶點(diǎn)的結(jié)合，如Stat1、Cdr2、Wnt5a、Runx1和后HoxA基因（圖5d）。Lin^-c-Kit+細(xì)胞基因組中HoxBlinc結(jié)合位點(diǎn)的整體分布表明，HoxBlinc主要與非編碼區(qū)相互作用，包括基因間區(qū)、內(nèi)含子和啟動(dòng)子。值得強(qiáng)調(diào)的是，HoxBlinc的過(guò)表達(dá)顯著增加了其與啟動(dòng)子和UTR的占用（圖5e）。整合來(lái)自WT和HoxBlincTg HSPC的ChIRP-seq、RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)集顯示，大約74%的基因HoxBlinc結(jié)合增加表現(xiàn)在基因表達(dá)水平增加兩倍以上（圖5f），44.7%的基因表現(xiàn)出啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性增強(qiáng)（圖5g）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc直接結(jié)合造血特異性靶基因，主要是NPM1c+特征基因，并介導(dǎo)染色質(zhì)的長(zhǎng)程相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖5 HoxBlinc直接與靶基因結(jié)合，介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用，驅(qū)動(dòng)HSPC中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

7、MLL1的募集對(duì)于HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的靶基因表達(dá)和HSPC功能異常至關(guān)重要

由于HoxBlinc招募SETD1A和MLL1復(fù)合物在小鼠ECS衍生的原始紅細(xì)胞祖細(xì)胞的HoxB位點(diǎn)組織活性染色質(zhì)域。所以作者先證實(shí)了人類HOXBLINC與MLL1和SETD1A的相互作用。然后體內(nèi)外研究SETD1A和MLL1在HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的HSPC功能異常和白血病發(fā)生中是否重要。然而，在HoxBlincTg LSK細(xì)胞中，敲除Mll1而非Setd1a能夠緩解HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的異常復(fù)制潛能（圖6a）。當(dāng)使用表達(dá)慢病毒對(duì)照或shMll1的HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞進(jìn)行移植時(shí)，與表達(dá)HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞的shScramble相比，mll1KD顯著延長(zhǎng)了接受shMll1表達(dá)HoxBlincTg Lin c-Kit+細(xì)胞的受體的存活時(shí)間(圖6b)。而mll1KD也能很大程度上恢復(fù)HoxBlincTg小鼠中CD117+/CD11b+未成熟髓系細(xì)胞和GMPs的異常擴(kuò)增以及貧血(圖6c, d)。這些數(shù)據(jù)表明Mll1 KD能夠緩解HoxBlinc過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的AML發(fā)展。

由于MLL1在HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的異常造血過(guò)程中至關(guān)重要，HSPC中HoxBlinc過(guò)表達(dá)可能通過(guò)增加MLL1募集來(lái)激活其靶基因，從而提高H3K4me3占用率，以促進(jìn)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子染色質(zhì)的可及性。為了證實(shí)這一點(diǎn)，使用WT和HoxBlincTg LSK細(xì)胞進(jìn)行了MLL1和H3K4me3 ChIP-seq。ChIP-seq和CHIRP-seq聯(lián)合分析顯示HoxBlinc和MLL1的基因組結(jié)合位點(diǎn)存在高度重疊（圖6e-g）。令人驚訝的是，51.2%的基因HoxBlinc結(jié)合增加顯示MLL1招募增加，其中大部分(31.7%)也顯示H3K4me3占用增加，包括NPM1c+-標(biāo)記基因，如前HoxB、后HoxA、Meis1和Runx1，以及其他造血基因，如Stat1和Cdr2（圖6e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，HoxBlinc過(guò)表達(dá)通過(guò)增加MLL1的募集和隨后H3K4me3占用的增強(qiáng)來(lái)介導(dǎo)靶基因的表達(dá)。

圖6 MLL1的募集對(duì)于HoxBlinc過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的靶基因表達(dá)和HSPC功能異常至關(guān)重要

總之，本文發(fā)現(xiàn)HOXBLINC過(guò)表達(dá)是驅(qū)動(dòng)白血病發(fā)生的關(guān)鍵事件，通過(guò)控制MLL1招募、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域和啟動(dòng)子的順式和反式表達(dá)，建立異常NPM1c+標(biāo)記基因表達(dá)程序。因此，本研究不僅為HSC和NPM1突變的AML的生物學(xué)提供了分子視角，而且還為NPM1c+ AML的藥物靶點(diǎn)識(shí)別創(chuàng)造了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。

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