m6A閱讀器YTHDC2通過抑制SLC7A11依賴性抗氧化功能抑制肺腺癌腫瘤發(fā)生

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2021-08-18
N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各種人類癌癥中的關(guān)鍵作用,包括肺癌。今天來講一篇關(guān)于m6A與肺癌的文章......

肺腺癌 (LUAD) 是最常見的非小細(xì)胞肺癌類型。然而,LUAD 腫瘤發(fā)生的潛在機制在很大程度上是未知的。N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各種人類癌癥中的關(guān)鍵作用,包括肺癌。今天來講一篇關(guān)于m6A與肺癌的文章,題名為:The m 6 A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant functionIF=11.79)。

YTHDC2的抑制與LUAD中的腫瘤進(jìn)展有關(guān)

為了評估m6A閱讀器在肺癌中的表達(dá)譜,通過 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析了已知的閱讀器,包括 YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/GeIF3A、FMR1 IGF2BP1/2。其中,與正常肺相比,LUAD LUSC 中只有 YTHDC2 下調(diào)。然而,IGF2BP2 LUAD LUSC 中差異表達(dá)。Oncomine 數(shù)據(jù)庫還顯示 YTHDC2 LUAD 中通常被下調(diào)。Kaplan-Meier 圖的分析進(jìn)一步表明,較低的 YTHDC2 LUAD 中較差的總體生存率相關(guān)。這些結(jié)果使我們研究了 YTHDC2 LUAD 中的作用。

患者肺癌組織樣本中,與鄰近的正常組織相比,在腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA 和蛋白質(zhì)的顯著下調(diào)。類似地,與 BEAS-2B 細(xì)胞相比,已建立的 LUAD 細(xì)胞系中的 YTHDC2 減少。組織芯片分析表明 YTHDC2 51% (98/192) LUAD 患者中下調(diào)。值得注意的是,YTHDC2 的下調(diào)與更大的腫瘤直徑和更晚期的階段有關(guān)。表明 YTHDC2 抑制促進(jìn)了 LUAD 中的腫瘤進(jìn)展。


YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域表現(xiàn)出抗腫瘤活性

為了在體內(nèi)探索YTHDC2 m 6 A 閱讀器功能,在有或沒有 m 6 A 識別 YTH 結(jié)構(gòu)域的情況下實現(xiàn)了 YTHDC2 的肺過表達(dá),并生成了基于 KP GFP 標(biāo)記的 KPY WT、KPY ΔYTH和對照 KPE 小鼠。除了強烈的 GFP 信號外,與感染后 25 周的 KPE 小鼠相比,YTHDC2 被證實在來自 KPY WT KPY ΔYTH小鼠的腫瘤中持續(xù)上調(diào)。,表明 AAV5 表達(dá)系統(tǒng)的持久效率。盡管YTHDC2無法阻止肺腫瘤發(fā)生,但腫瘤發(fā)生時間被延遲,壓倒性的肺腫瘤負(fù)荷被顯著抑制,KPY WT小鼠的存活時間比KPE小鼠和KPY ΔYTH小鼠長。




我們進(jìn)一步研究了 YTHDC2 是否是人類 LUAD 細(xì)胞中的腫瘤抑制因子。選擇 H1975 H1299 細(xì)胞是因為它們分別在測試的 LUAD 細(xì)胞系中表現(xiàn)出最高和最低的 YTHDC2 表達(dá)。IB 檢測證實了 YTHDC2 的過表達(dá)和敲除效率。雖然在 H1299 細(xì)胞中YTHDC2 WT過表達(dá)后3D 球體的數(shù)量和大小以及異種移植物的腫瘤生長減少,但在 YTHDC2 ΔYTH過表達(dá)后未觀察到這些影響。相比之下,敲除 H1975 細(xì)胞中的 YTHDC2 會增加小鼠的球體形成和異種移植物生長。值得注意的是,當(dāng)使用 YTHDC2 sg2-抗性(res)重建 YTHDC2 表達(dá)時,YTHDC2-sg2 在腫瘤發(fā)生中的積極作用得以恢復(fù)。因此,YTHDC2 通過其 m 6 A 閱讀域在 LUAD 中發(fā)揮腫瘤抑制功能。這些結(jié)果也解釋了為什么 Ythdc2 在鼠腫瘤中的顯著表達(dá)和 H1299 細(xì)胞中的 YTHDC2當(dāng)突變體過表達(dá)時,沒有改變轉(zhuǎn)化表型。

YTHDC2 抑制胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

通常在具有高致瘤特性的腫瘤中觀察到代謝活性。為了研究 YTHDC2 對代謝物的影響,進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,比較了具有低和高 YTHDC2 表達(dá)(的LUAD 標(biāo)本。GSH 代謝是確定的前 20 KEGG 途徑之一。在顯著改變的代謝物中,與 YTHDC2高腫瘤相比,在 YTHDC2低腫瘤中觀察到胱氨酸增加了 3.975 倍。此外,觀察到 YTHDC2 與細(xì)胞內(nèi)胱氨酸之間呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明 YTHDC2 減少細(xì)胞內(nèi)胱氨酸。

為了驗證 YTHDC2 是否降低了胱氨酸攝取,我們培養(yǎng)了具有高 (pHY#1-8) 或低 (pLY#1-8) YTHDC2 表達(dá)水平的原代患者來源的 LUAD 細(xì)胞。L- 14 C-胱氨酸攝取測定結(jié)果表明,YTHDC2 通過其 YTH 結(jié)構(gòu)域抑制了 H1299 H1975 細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植物、小鼠形成的 LUAD 和患者來源的 LUAD 細(xì)胞中的胱氨酸攝取。已顯示CHAC1 mRNA 水平的上調(diào)表明胱氨酸攝取受損。事實上,觀察到 YTHDC2 增加了CHAC1 mRNA 水平。胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng) Xc -通過谷氨酸的反向轉(zhuǎn)運導(dǎo)入胱氨酸。谷氨酸釋放測定結(jié)果顯示 YTHDC2 抑制谷氨酸釋放。這些結(jié)果表明 YTHDC2 通過抑制系統(tǒng) Xc - 來損害胱氨酸攝取。System Xc -對氧化還原平衡和新陳代謝至關(guān)重要,以及YTHDC2 YTH 結(jié)構(gòu)域?qū)?/span> H1299 H1975 細(xì)胞中GSH/GSSG NAD + /NADH 比率的改變,進(jìn)一步表明 YTHDC2 可能損害系統(tǒng) Xc -功能。

受損的系統(tǒng) Xc -功能與 GSH 水平降低有關(guān)。來自患者來源的 LUAD 細(xì)胞和小鼠腫瘤的數(shù)據(jù)表明 YTHDC2 確實降低了 GSH。為了研究下游的胱氨酸抗氧化劑是否補償了 YTHDC2 的抗腫瘤作用,給小鼠注射了 GSH NAC,一種半胱氨酸前體。給予 NAC GSH KPY WT小鼠肺中的腫瘤負(fù)荷顯著高于載體治療的對照小鼠,并且水平與 KPE 小鼠相似。有趣的是,與KPE 小鼠相比,GSH NAC 給藥僅導(dǎo)致 KPY WT小鼠腫瘤中 GSH/GSSG 比率的顯著增加。該結(jié)果的一個潛在原因是 YTHDC2 損害系統(tǒng) Xc -,我們提出系統(tǒng) Xc -功能的損害可能對促進(jìn) GSH 及其除胱氨酸以外的原料,如半胱氨酸或其前體進(jìn)入細(xì)胞。




正如之前的研究中所報道的,缺乏 GSH 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加。因此,熒光探針(C11-BODIPY 581/591)用于測量小鼠 LUAD 中的氧化脂質(zhì)。此外,作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的 4-HNE MDA 水平在 KPY WT的腫瘤中增加,但在 KPY ΔYTH 中沒有增加小鼠與 KPE 小鼠相比。值得注意的是,在 KPY WT小鼠中,NAC GSH 補充劑可減少脂質(zhì)過氧化并縮短存活時間??傮w而言,這些結(jié)果表明YTHDC2 m 6 A 讀取功能對于減少胱氨酸下游抗氧化程序至關(guān)重要

YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達(dá)

雖然抑制系統(tǒng) Xc -功能與 YTHDC2 受損的胱氨酸攝取有關(guān),YTHDC2 如何調(diào)節(jié)系統(tǒng) Xc -仍不清楚。SLC7A11,催化亞基,在維持系統(tǒng) Xc -活性方面發(fā)揮著重要作用。使用 UALCAN 數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)與正常肺相比,LUAD 中的 SLC7A11 上調(diào)。此外,較高的 SLC7A11 導(dǎo)致 LUAD 患者的總生存期較短。值得注意的是,YTHDC2 LUAD 中的 SLC7A11 呈負(fù)相關(guān)。因此,SLC7A11 可能與 YTHDC2 的功能相反,以維持胱氨酸攝取。

接下來,研究了 YTHDC2 是否調(diào)節(jié) SLC7A11。在 H1299 H1975 細(xì)胞中,SLC7A11 的蛋白質(zhì)和 mRNA 水平都受到 YTHDC2 的負(fù)調(diào)控。在小鼠中,與來自 KPE KPY ΔYTH小鼠的腫瘤相比,來自 KPY WT小鼠的腫瘤中的 Slc7a11 下調(diào)。此外,YTH 結(jié)構(gòu)域是 YTHDC2 抑制 SLC7A11 表達(dá)的先決條件。

隨后,我們研究了 YTHDC2 是否通過 SLC7A11 抑制胱氨酸攝取。當(dāng) YTHDC2 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時,異位表達(dá) SLC7A11 完全恢復(fù)了受損的胱氨酸攝取。相反,YTHDC2 缺失誘導(dǎo)的胱氨酸攝取被靶向 H1975 細(xì)胞中 SLC7A11 shRNA 逆轉(zhuǎn)。ATF4 NRF2 SLC7A11轉(zhuǎn)錄的兩個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。與 ATF4 不同,NRF2 無法上調(diào) H1299 細(xì)胞中的 SLC7A11,這可能是由于 LUAD 單元格上下文特定的影響。值得注意的是,過表達(dá) YTHDC2 仍然拮抗 ATF4 的作用。因此,YTHDC2 損害依賴于 SLC7A11 的胱氨酸攝取。

還研究了換著樣本中 YTHDC2 SLC7A11 的臨床相關(guān)性。與鄰近組織相比,YTHDC2 在腫瘤中被下調(diào),而 SLC7A11 在腫瘤中被上調(diào)。此外,它們在腫瘤中呈負(fù)相關(guān)。


YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減

進(jìn)一步研究了通過 YTHDC2 調(diào)節(jié) SLC7A11 表達(dá)的機制。因為 SLC7A11 mRNA 和蛋白質(zhì)水平都受到 YTHDC2 的負(fù)調(diào)控,我們想確定 SLC7A11 mRNA 和蛋白質(zhì)水平是否都被 YTHDC2 抑制。為了解決這個問題,首先研究了 YTHDC2 是否調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA。當(dāng) YTHDC2 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時,YTH 結(jié)構(gòu)域在抑制SLC7A11啟動子活性方面沒有作用。敲除 YTHDC2 然后在 H1975 細(xì)胞中重建其表達(dá)也表明 YTHDC2 調(diào)節(jié)SLC7A11轉(zhuǎn)錄。然后,我們用泛轉(zhuǎn)錄抑制劑 ActD 處理 H1299 H1975 細(xì)胞,以檢查 YTHDC2 是否在轉(zhuǎn)錄被阻斷后調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn) YTH 結(jié)構(gòu)域?qū)τ?/span> YTHDC2 縮短SLC7A1 1 mRNA的半衰期是必不可少的H1299 細(xì)胞。通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)喪失 YTHDC2 功能,隨后在 H1975 細(xì)胞中重建 YTHDC2 進(jìn)一步證實 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰減。。刪除 EXOSC10 而不是 XRN2,減弱了 YTHDC2 對縮短SLC7A1 1 mRNA 半衰期的影響。,表明 YTHDC2 促進(jìn) 3'-5' SLC7A1 1 mRNA 降解。在藥理學(xué)水平上,用 DEPC RNasin 這兩種泛 RNase 抑制劑處理 H1299 細(xì)胞也阻斷了 YTHDC2 的功能。這些發(fā)現(xiàn)確立了 YTHDC2 在破壞LUAD 細(xì)胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性中的作用。

YTHDC2 調(diào)節(jié)SLC7A1 1 mRNA 穩(wěn)定性,控制 RNA 衰變是 m 6 A 甲基化的重要功能之一。。YTHDC2抑制SLC7A11的功能是否依賴于m 6 A甲基化仍然未知。在三個主要作者中,即 METTL3、METTL14 WTAP,與 H1299 細(xì)胞相比,僅發(fā)現(xiàn)較高的 METTL3 表達(dá)水平與 H1975 細(xì)胞中較高的整體 m 6 A 甲基化水平相關(guān)。METTL3增加H1299H1975細(xì)胞中m 6A。在 H1975 細(xì)胞中敲低 METTL3 延長了SLC7A1 1 mRNA的半衰期,而在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) METTL3 加速了SLC7A1 1 mRNA 降解。此外,H1299 細(xì)胞中降低的 METTL3 表達(dá)會阻止 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰變,損害胱氨酸攝取并刺激脂質(zhì)活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生。表明 YTHDC2 LUAD 細(xì)胞中的作用是 m 6 A 依賴性的。


SLC7A1 1 mRNA m 6 A 甲基化

為了揭示SLC7A1 1 mRNA 中潛在的 m 6 A 甲基化位點,在H1975細(xì)胞中 METTL3 敲低之前和之后進(jìn)行了 MeRIP-seq。GGAC 基序在 H1975 細(xì)胞的m6A 位點高度富集,無論是否敲除METTL3。m6A 峰在靠近 mRNA 終止密碼子的 3' 非翻譯區(qū) (3'UTR) 中尤為豐富。MeRIP-seq 揭示了一個推定的m6A 基序位于 3'UTR。該位點周圍的 m 6 A 富集與 m 6 A 甲基化水平相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)SLC7A1 1 mRNA m6A 依賴性修飾,進(jìn)行了 MeRIP-qPCR。在H1975細(xì)胞中敲除 METTL3 后,SLC7A1 1 mRNA 中的m 6 A 修飾在推定的 m 6 A 位點周圍顯著減少。相反,當(dāng) METTL3 H1299 細(xì)胞中過表達(dá)時,觀察到相反的結(jié)果。因此,我們提供了證據(jù)表明SLC7A1 1 mRNA 可以在 LUAD 細(xì)胞中被 m 6 A 甲基化。

盡管 YTHDC2 用作 m6A 閱讀器,但YTHDC2是否優(yōu)先結(jié)合并識別 m 6 A 甲基化的SLC7A1 1 mRNA 尚不清楚。首先進(jìn)行了評估SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。結(jié)果表明,通過在 H1299 細(xì)胞中過表達(dá) METTL3來增加 m 6 A 甲基化水平促進(jìn)了 YTHDC2 SLC7A1 1 mRNA 的結(jié)合。相比之下,一旦 METTL3 H1975 細(xì)胞中被敲除,SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用就被顯著抑制。無論 METTL3 是過度表達(dá)還是被敲低,YTH 結(jié)構(gòu)域的缺失都會阻止SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。接下來,我們使用合成的部分SLC7A11 3'UTR 探針進(jìn)行了體外 RNA 下拉測定,并將它們與來自表達(dá) HA 標(biāo)記的 YTHDC2 WT YTHDC2 ΔYTH H1299 細(xì)胞的裂解物一起孵育。YTHDC2 WT,但不是 YTHDC2 ΔYTH,與含有未甲基化腺苷的SLC7A1 1 mRNA 3'UTR相比,更優(yōu)先結(jié)合含有 m 6 A mRNA。此外,YTHDC2 易于結(jié)合 m 6 A 共有基序 GGAC,這與位于推定的 m 6 A 位點內(nèi)的相同,因為當(dāng) GGAC 被取代時,觀察到SLC7A11 3'UTR-YTHDC2 相互作用顯著減少一個隨機的 CCAG 主題。最后,進(jìn)行了 RIP-qPCR 測定以評估 m6 A 甲基化是否調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。實際上,與 H1299 細(xì)胞相比,更高的整體 m 6 A 甲基化在H1975細(xì)胞中引起了更強的SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。從 METTL3 H1299 H1975 細(xì)胞中的功能獲得和喪失實驗中,我們還得出結(jié)論,細(xì)胞內(nèi)SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用是由 m 6 A 水平?jīng)Q定的。這些數(shù)據(jù)表明YTHDC2優(yōu)先結(jié)合m 6 A-甲基化的SLC7A1 1 mRNA




然后,我們檢查了YTHDC2 是否通過假定的m6A 位點使SLC7A1 1 mRNA不穩(wěn)定。我們克隆野生型(WTSLC7A11 3'UTR和突變型(MUT3'UTR的螢火蟲熒光素酶的下游pmirGLO 質(zhì)粒中的編碼區(qū)。結(jié)果表明,僅過表達(dá) YTHDC2 WT而不是過表達(dá)YTHDC2 ΔYTH 會降低H1299 細(xì)胞中SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性,而敲除 YTHDC2 可增加其在 H1975 細(xì)胞中的穩(wěn)定性。然而,與 WT 3'UTR 相比,Mut 報告基因的這些影響減弱了。在檢查pmirGLO 質(zhì)粒表達(dá)的外源F-Luc-SLC7A11融合 mRNA RNA 穩(wěn)定性后,獲得了類似的結(jié)果。??傮w而言,3'UTR m 6 A 位點對于 YTHDC2 破壞SLC7A1 1 mRNA 的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

具有 YTHDC2 抑制的 LUAD 對系統(tǒng) X C -靶向治療敏感

為了評估 YTHDC2 抑制在 LUAD 中的重要性,患者樣本中隨機選擇了20 YTHDC2LUAD,其中 50% 屬于腺泡亞型。。要了解YTHDC2的患病率較低的腺泡亞型,另一種群組#2被吸收特定于腺泡亞型。在隊列#2n = 100)中,與鄰近組織相比,腫瘤中的 YTHDC2 下調(diào),并且 62%62/100)的腺泡組織被歸類為 YTHDC2低與沒有這種表達(dá)模式的患者相比,YTHDC2低的腺泡 LUAD 患者的總生存期要短得多。進(jìn)一步證明 YTHDC2 抑制可能對腺泡 LUAD 的腫瘤進(jìn)展特別重要。

YTHDC2抑制SLC7A11; 因此,我們推測 SLC7A11 在腺泡 LUAD 中同時上調(diào)。事實上,這在隊列#2 中是正確的。最近,使用系統(tǒng) X C -抑制劑。我們想知道哌嗪埃拉汀 (PKE) 是一種穩(wěn)定的埃拉汀體內(nèi)衍生物,是否對腺泡 LUAD 具有潛在的治療作用。此外,同時對索拉非尼進(jìn)行了檢查。PDX 小鼠模型對于評估患者的治療敏感性很有價值。因此,來自 4 名不同腺泡 LUAD 患者的 PDX 模型被給予 PKE 和索拉非尼。由于小鼠傳代,未觀察到 YTHDC2 SLC7A11 的組織病理學(xué)和表達(dá)的顯著變化。與 DMSO 處理的對照相比,當(dāng)給予 PKE 和索拉非尼時,觀察到顯著的腫瘤消退。此外,給小鼠服用PKE和索拉非尼也會導(dǎo)致腫瘤中MDA4-HNE的顯著增加。表明誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可能是抑制腺泡 LUADs 腫瘤發(fā)生的結(jié)果。

最后,我們招募了另外兩個隊列來驗證我們的結(jié)論。雖然第 3 LUAD 患者是從華北招募的,第 4 組也從中國上海招募,但時間范圍與第 1 組不同。與隊列#1 的觀察結(jié)果相似,MDA YTHDC2 受到抑制,而與隊列 #3 中的鄰近組織相比,腫瘤中 SLC7A11 mRNA 和蛋白質(zhì)水平均升高(n = 30),證實了 LUAD YTHDC2 的抑制通過上調(diào) SLC7A11 來防止脂質(zhì)過氧化。在隊列#4n = 20/每個階段)中,MDA YTHDC2 呈負(fù)相關(guān),而 SLC7A11 與階段正相關(guān),表明 SLC7A11 升高可能是抑制 YTHDC2 以促進(jìn) LUAD 進(jìn)展的關(guān)鍵