SIRT1與CRL4B復(fù)合物協(xié)同調(diào)控胰腺癌干細(xì)胞特性促進(jìn)腫瘤發(fā)生

   胰腺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，預(yù)后較差。最近，腫瘤干細(xì)胞(CSCs)被發(fā)現(xiàn)存在于包括胰腺癌在內(nèi)的幾種實(shí)體腫瘤中。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明sirtuin 1 (SIRT1)在各種癌癥中發(fā)揮著生物學(xué)功能，但它是如何參與胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，以及它在CSCs中的作用仍不明確。2021年6月發(fā)表于“Cell Death & Differentiation”（IF=15.828）的文章“SIRT1 coordinates with the CRL4B complex to regulate pancreatic cancer stem cells to promote tumorigenesis”對(duì)此展開了研究。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1與CRL4B復(fù)合物相互作用，該復(fù)合物負(fù)責(zé)H2AK119泛素化。SIRT1/CUL4B靶點(diǎn)的全基因組分析確定了一組基因，包括GRHL3和FOXO3，它們?cè)诩?xì)胞分化、生長(zhǎng)和遷移中起關(guān)鍵作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B共同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、自噬和侵襲。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1/CUL4B促進(jìn)CSC樣特性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，SIRT1促進(jìn)了已建立的腫瘤異種移植瘤的生長(zhǎng)，增加了NOD/SCID小鼠的腫瘤起始能力，增加了CSC頻率。值得注意的是，SIRT1和CUL4B的表達(dá)在包括胰腺癌在內(nèi)的多種人類癌癥中顯著上調(diào)。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）sirtuin對(duì)胰腺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣表型影響的系統(tǒng)分析

7個(gè)人類sirtuin成員(SIRT1-7)共享一個(gè)保守的NAD+依賴的去乙?；附Y(jié)構(gòu)域(圖1A)。為了研究sirtuins是否影響胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型，flag標(biāo)記的SIRT1-7在PANC-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。過(guò)表達(dá)SIRT1的細(xì)胞中CD133+細(xì)胞含量增加(圖1B)，其他細(xì)胞無(wú)明顯變化。過(guò)表達(dá)SIRT1的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物上調(diào)，而過(guò)表達(dá)其他sirtuin家族成員只改變了部分CSC標(biāo)記物的表達(dá)(圖1C和D)。SIRT1敲低后，這些因素的表達(dá)下降。此外，敲低SIRT2-7并沒(méi)有引起這些CSC標(biāo)記物表達(dá)的統(tǒng)一變化(圖1E和F)。綜上所述，這些結(jié)果表明SIRT1似乎與CSC相關(guān)的特性有關(guān)，如CD133表達(dá)和干性基因水平。

2）SIRT1與CRL4B復(fù)合體相關(guān)

為了更好地理解SIRT1在胰腺癌中的作用機(jī)制，我們使用親和純化和質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示SIRT1與各種表觀遺傳因子共純化(圖2A)。在列出的蛋白中，SIRT1與MTA1、HDAC1/2、EED和SAP30的關(guān)聯(lián)已有報(bào)道。western blot進(jìn)一步證實(shí)了SIRT1相關(guān)復(fù)合物中存在這些蛋白(圖2B)。除了先前報(bào)道的與SIRT1相互作用的蛋白外，新發(fā)現(xiàn)的SIRT1相關(guān)蛋白DDB1表明，SIRT1可能與CRL4B復(fù)合物的組成部分CUL4B和ROC1在物理上相互作用(圖2B)。為了進(jìn)一步證實(shí)SIRT1和CRL4B復(fù)合物在體外的相互作用，我們?cè)谒姆N胰腺癌細(xì)胞株中進(jìn)行了co-IP檢測(cè)，結(jié)果顯示SIRT1與CRL4B復(fù)合物共免疫沉淀(圖2C)。為了確定SIRT1/CRL4B復(fù)合物的存在，我們使用FPLC對(duì)核蛋白進(jìn)行了蛋白分離實(shí)驗(yàn)。Western blotting顯示，SIRT1的洗脫模式與CRL4B組分的洗脫模式大部分重疊(圖2D)，支持了SIRT1和CRL4B復(fù)合物可能在體內(nèi)有功能合作的論點(diǎn)。接下來(lái)，GST下拉分析結(jié)果顯示SIRT1直接與CUL4B和DDB1相互作用(圖2E)。此外，SIRT1的N-terminal負(fù)責(zé)CUL4B的結(jié)合，而C-terminal是DDB1的結(jié)合所必需的(圖2F(a))。結(jié)果還表明，CUL4B NEDD8結(jié)構(gòu)域直接參與與SIRT1相互作用(圖2F(b))。CUL4B類泛素化位點(diǎn)先前已報(bào)道在氨基酸836-843上。結(jié)果顯示，具有泛素化位點(diǎn)缺失的CUL4B NEDD8結(jié)構(gòu)域仍然直接與SIRT1相互作用(圖2F(c))，表明SIRT1與CUL4B的相互作用不依賴于類泛素化修飾。GST下拉分析表明，DDB1 BPC結(jié)構(gòu)域與SIRT1相互作用(圖2F(d))。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步支持了SIRT1與CRL4B復(fù)合物之間的特異性相互作用，而且揭示了SIRT1/CRL4B復(fù)合物形成的分子機(jī)制(圖2G)。

為了進(jìn)一步探索SIRT1和CUL4B之間的功能關(guān)系，我們研究了SIRT1或CUL4B是否會(huì)改變H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac和H2AK119ub1的整體水平。Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SIRT1降低了H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac，而顯著增加了H2AK119ub1(圖2H)。在PAN1細(xì)胞中敲除SIRT1，這些組蛋白位點(diǎn)表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。CUL4B過(guò)表達(dá)顯著增加H2AK119ub1，降低H4K16ac；CUL4B下調(diào)后，H2AK119ub1顯著降低，H3K9ac、H3K14ac和H4K16ac略有升高(圖2H)。這些結(jié)果提供了支持SIRT1和CRL4B復(fù)合物相互作用的特定機(jī)制的證據(jù)；從而確定SIRT1和CUL4B的功能連通性。

3）SIRT1/CRL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)的全基因組識(shí)別

接下來(lái)，我們使用ChIP-seq分析全基因組SIRT1/CRL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B特異性結(jié)合峰分別為10455和12591(圖3A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B具有相似的結(jié)合基元(圖3B)，這支持了它們?cè)谖锢砩舷嗷プ饔貌⒃诠δ苌舷嗷ミB接的觀點(diǎn)。然后，對(duì)SIRT1(1560個(gè)基因)和CUL4B(2369個(gè)基因)的DNA啟動(dòng)子序列進(jìn)行重疊分析；這些啟動(dòng)子代表了SIRT1/CRL4B復(fù)合物的共同靶點(diǎn)(圖3C)。我們鑒定了288個(gè)SIRT1和CUL4B特異性啟動(dòng)子，并將它們分為不同的細(xì)胞信號(hào)通路，包括Rap1、AMPK、FoxO、Hippo、細(xì)胞周期、黏附、以及調(diào)控干細(xì)胞的多能性，這在腫瘤的形成和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用(圖3D)。qChIP分析顯示，SIRT1和CUL4B對(duì)FOXO3、GRHL3、NAV3、AF6、PRDM2、MOB1A、DLG1、CTNNA1和CTNNA3等經(jīng)典通路基因的啟動(dòng)子具有強(qiáng)富集作用(圖3E)。RT-qPCR進(jìn)一步顯示，SIRT1或CUL4B敲低后，PANC-1細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄水平部分升高(圖3F)。ChIP實(shí)驗(yàn)表明，SIRT1或CUL4B缺失的PANC-1細(xì)胞中，SIRT1和CUL4B向其靶啟動(dòng)子的募集均減少(圖3G和H)。因此，SIRT1和CRL4B可能相互促進(jìn)對(duì)方在靶啟動(dòng)子上的募集或穩(wěn)定，形成抑制靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。

4）通過(guò)SIRT1/CRL4B復(fù)合物調(diào)控FOXO3和GRHL3

我們?cè)u(píng)估了靶向SIRT1和CUL4B mRNA的慢病毒shRNA(圖4A)，選擇最有效的進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。FOXO3是一個(gè)成熟的腫瘤抑制基因，參與多種細(xì)胞過(guò)程；GRHL3是分化所必需的，并具有抑制腫瘤的作用。因此，我們研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物對(duì)FOXO3和GRHL3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。SIRT1或CUL4B敲低導(dǎo)致PANC-1(圖4B和C)和AsPC-1(圖4D和E)細(xì)胞中FOXO3和GRHL3的表達(dá)增加。在PANC-1細(xì)胞中，通過(guò)ChIP或ChIP/Re-ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物介導(dǎo)的FOXO3和GRHL3的調(diào)控(圖4F)。這些結(jié)果支持了SIRT1和CRL4B復(fù)合物作為一個(gè)蛋白復(fù)合物占據(jù)FOXO3和GRHL3啟動(dòng)子。此外，qChIP分析表明，敲除SIRT1、CUL4B或DDB1的表達(dá)導(dǎo)致FOXO3和GRHL3啟動(dòng)子相應(yīng)蛋白的募集顯著減少(圖4 G)。SIRT1下調(diào)不僅導(dǎo)致FOXO3和GRHL3啟動(dòng)子H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac升高，還顯著降低了H2AK119ub1水平。CUL4B或DDB1基因敲低也得到類似的結(jié)果，表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物作為一個(gè)整體與FOXO3和GRHL3啟動(dòng)子結(jié)合，催化組蛋白的泛素化和去乙?；?/span>(圖4G)。這進(jìn)一步證實(shí)了SIRT1和CRL4B復(fù)合物通過(guò)一組靶基因(如FOXO3和GRHL3)的轉(zhuǎn)錄抑制在功能上存在關(guān)聯(lián)。

5）SIRT1和CUL4B共同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、自噬和轉(zhuǎn)移

我們研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物在胰腺癌細(xì)胞增殖、自噬和轉(zhuǎn)移中的作用。生長(zhǎng)曲線分析顯示，SIRT1和CUL4B促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖5A)。EdU結(jié)果顯示，在EdU標(biāo)記的細(xì)胞中，SIRT1或CUL4B過(guò)表達(dá)與明顯的百分比增加相關(guān)，而SIRT1或CUL4B敲低的細(xì)胞顯示這些細(xì)胞的百分比要低得多(圖5B)。這表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物在體外促進(jìn)了胰腺細(xì)胞的增殖。

有報(bào)道稱自噬阻斷降低了胰腺CSC活性。因此，我們接下來(lái)研究了SIRT1和CUL4B在自噬中的作用。在EGFP-LC3 PANC-1細(xì)胞中，SIRT1或CUL4B過(guò)表達(dá)增加LC3斑點(diǎn)(圖5C)。在mCherryGFP-LC3 PANC-1細(xì)胞中，SIRT1或CUL4B過(guò)表達(dá)顯示GFP-/mCherry+(紅色斑點(diǎn))自噬溶酶體增加，在較小程度上，GFP+/mCherry+(黃色斑點(diǎn))吞噬體/自溶噬體增加(圖5D)。接下來(lái)，用LysoTracker Red對(duì)溶酶體隔室進(jìn)行染色，顯示過(guò)表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1細(xì)胞中溶酶體區(qū)域擴(kuò)大(圖5E)。此外，流式細(xì)胞術(shù)顯示過(guò)表達(dá)SIRT1或CUL4B的細(xì)胞中LysoTracker+細(xì)胞含量增加(圖5F)。我們使用自噬體和溶酶體融合抑制劑巴菲霉素A1 (BafA1)進(jìn)行自噬通量分析。經(jīng)過(guò)BafA1處理后，SIRT1和CUL4B的增加與LC3-II的積累相關(guān)。western blot分析也證實(shí)了SIRT1和CUL4B基因下調(diào)導(dǎo)致的自噬通量缺陷(圖5G和圖S3C)。這些結(jié)果表明，SIRT1或CUL4B過(guò)表達(dá)不僅增強(qiáng)了自噬通量，還增強(qiáng)了溶酶體功能。

接下來(lái)，western blot顯示上皮標(biāo)記物，如α-和γ-catenin表達(dá)減少，而間質(zhì)標(biāo)記物，包括N-cadherin和Vimentin，在SIRT1或CUL4B過(guò)表達(dá)時(shí)增加(圖5H)。在PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中單個(gè)敲除SIRT1或CUL4B時(shí)，這些EMT標(biāo)記物表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。此外，在PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中進(jìn)行transwell侵襲檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SIRT1或CUL4B導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增加超過(guò)兩倍，而敲除SIRT1或CUL4B則導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力明顯降低(圖5I)。下調(diào)CUL4B或SIRT1后，過(guò)表達(dá)SIRT1或CUL4B的作用減弱，同時(shí)下調(diào)SIRT1和CUL4B后，細(xì)胞侵襲能力明顯減弱(圖5I)。在PANC-1細(xì)胞中敲低SIRT1或CUL4B降低了細(xì)胞侵襲潛能，這部分可通過(guò)共同敲低FOXO3或GRHL3來(lái)挽救，表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物可通過(guò)抑制FOXO3和GRHL3來(lái)促進(jìn)胰腺癌侵襲(圖5J)。這些結(jié)果表明，SIRT1/CRL4B復(fù)合物促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲潛能，部分通過(guò)抑制FOXO3和GRHL3。

 6）SIRT1和CUL4B促進(jìn)胰腺癌干細(xì)胞特性

我們研究了SIRT1和CUL4B是否影響胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型。在穩(wěn)定表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中，干細(xì)胞標(biāo)記物均增加(圖6A)。為了進(jìn)一步闡明SIRT1和CUL4B是否促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞向CSCs的發(fā)展，我們分析了SIRT1和CUL4B對(duì)球體形成的影響。在穩(wěn)定表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中，球的數(shù)量和大小增加，而下調(diào)SIRT1或CUL4B后，球的數(shù)量和大小減少(圖6B)。接下來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)顯示過(guò)表達(dá)SIRT1和CUL4B后CD133+細(xì)胞數(shù)量增加，這一效應(yīng)在抑制CUL4B和SIRT1后部分被挽救(圖6C)。這些結(jié)果表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物促進(jìn)胰腺CSC特性。為了進(jìn)一步證實(shí)SIRT1在體內(nèi)靶向胰腺CSC群體，我們建立了小鼠異種移植模型。注射4周后，通過(guò)生物發(fā)光觀察移植細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(圖6D)。穩(wěn)定表達(dá)SIRT1的細(xì)胞顯著增加了腫瘤起始能力(圖6E)。SIRT1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比CSC頻率顯著增加(圖6F)。此外，SIRT1顯著促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(zhǎng)(圖6G)。這表明SIRT1可以顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞性，從而促進(jìn)腫瘤移植瘤的生長(zhǎng)。與腫瘤生長(zhǎng)加速一致，SIRT1過(guò)表達(dá)組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(圖6H)。我們利用RNA-seq研究了SIRT1過(guò)表達(dá)的全基因組效應(yīng)。與對(duì)照組相比，我們?cè)?/span>SIRT1過(guò)表達(dá)的腫瘤樣本中共發(fā)現(xiàn)了2506個(gè)上調(diào)基因和2229個(gè)下調(diào)基因(圖6I)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)的基因不僅參與病灶黏附、Wnt、Hippo、細(xì)胞周期等與腫瘤生長(zhǎng)和干性密切相關(guān)的途徑，而且在與自噬相關(guān)的吞噬小體和溶酶體途徑中富集(圖6J)。接下來(lái)，我們選擇了12個(gè)已知的腫瘤抑制因子與癌癥發(fā)展有關(guān)的基因，包括GRHL3、NAV3、AXIN2、FOXP1、WISP3、SPDEF、RASSF1、PTPRG、IGFBP4、FHL1、FEZ1和DUSP4，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了它們?cè)?/span>SIRT1過(guò)表達(dá)的腫瘤樣本中的表達(dá)降低(圖6K)。這些結(jié)果表明，SIRT1參與調(diào)節(jié)與腫瘤生長(zhǎng)、自噬和干細(xì)胞形成密切相關(guān)的各種通路，并促進(jìn)胰腺CSC的發(fā)展

7）SIRT1和CUL4B在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，是一種潛在的癌癥生物標(biāo)志物

我們收集了86例胰腺癌患者的樣本，通過(guò)免疫組化染色進(jìn)行組織微陣列，檢測(cè)SIRT1、CUL4B和FOXO3的表達(dá)情況(圖7A)。SIRT1和CUL4B在腫瘤中顯著上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，FOXO3表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(圖7B)。為了研究SIRT1和CUL4B的影響是否可以擴(kuò)展到更廣泛的癌癥范圍，我們收集了幾個(gè)癌癥樣本，對(duì)其進(jìn)行組織微陣列和免疫組化染色來(lái)檢測(cè)SIRT1和CUL4B的表達(dá)(圖7C)。結(jié)果顯示，除胰腺癌外，SIRT1和CUL4B在食管癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌中與癌旁正常組織相比也顯著上調(diào)(圖7D)?？傊?，我們的分析表明SIRT1和CUL4B在多種癌癥中上調(diào)，是潛在的癌癥生物標(biāo)志物。

結(jié)論： SIRT1和CRL4B作為一個(gè)功能單元相互作用和合作，提供了一種新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，同時(shí)也為染色質(zhì)重構(gòu)中組蛋白去乙酰化和泛素化提供了新的分子基礎(chǔ)。此外，SIRT1/CRL4B復(fù)合物有助于腫瘤抑制的表觀遺傳學(xué)沉默，也在胰腺癌的腫瘤發(fā)生和調(diào)節(jié)CSCs的特性中發(fā)揮重要作用。因此，SIRT1和CUL4B是潛在的致癌基因和生物標(biāo)志物，可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。