胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤,預(yù)后較差。最近,腫瘤干細(xì)胞(CSCs)被發(fā)現(xiàn)存在于包括胰腺癌在內(nèi)的幾種實體腫瘤中。盡管越來越多的證據(jù)表明sirtuin 1 (SIRT1)在各種癌癥中發(fā)揮著生物學(xué)功能,但它是如何參與胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,以及它在CSCs中的作用仍不明確。2021年6月發(fā)表于“Cell Death & Differentiation”(IF=15.828)的文章“SIRT1 coordinates with the CRL4B complex to regulate pancreatic cancer stem cells to promote tumorigenesis”對此展開了研究。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1與CRL4B復(fù)合物相互作用,該復(fù)合物負(fù)責(zé)H2AK119泛素化。SIRT1/CUL4B靶點的全基因組分析確定了一組基因,包括GRHL3和FOXO3,它們在細(xì)胞分化、生長和遷移中起關(guān)鍵作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B共同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、自噬和侵襲。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1/CUL4B促進(jìn)CSC樣特性。體內(nèi)實驗表明,SIRT1促進(jìn)了已建立的腫瘤異種移植瘤的生長,增加了NOD/SCID小鼠的腫瘤起始能力,增加了CSC頻率。值得注意的是,SIRT1和CUL4B的表達(dá)在包括胰腺癌在內(nèi)的多種人類癌癥中顯著上調(diào)。
技術(shù)路線
結(jié)果:
1)sirtuin對胰腺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣表型影響的系統(tǒng)分析
7個人類sirtuin成員(SIRT1-7)共享一個保守的NAD+依賴的去乙?;附Y(jié)構(gòu)域(圖1A)。為了研究sirtuins是否影響胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型,flag標(biāo)記的SIRT1-7在PANC-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。過表達(dá)SIRT1的細(xì)胞中CD133+細(xì)胞含量增加(圖1B),其他細(xì)胞無明顯變化。過表達(dá)SIRT1的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物上調(diào),而過表達(dá)其他sirtuin家族成員只改變了部分CSC標(biāo)記物的表達(dá)(圖1C和D)。SIRT1敲低后,這些因素的表達(dá)下降。此外,敲低SIRT2-7并沒有引起這些CSC標(biāo)記物表達(dá)的統(tǒng)一變化(圖1E和F)。綜上所述,這些結(jié)果表明SIRT1似乎與CSC相關(guān)的特性有關(guān),如CD133表達(dá)和干性基因水平。
2)SIRT1與CRL4B復(fù)合體相關(guān)
為了更好地理解SIRT1在胰腺癌中的作用機(jī)制,我們使用親和純化和質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示SIRT1與各種表觀遺傳因子共純化(圖2A)。在列出的蛋白中,SIRT1與MTA1、HDAC1/2、EED和SAP30的關(guān)聯(lián)已有報道。western blot進(jìn)一步證實了SIRT1相關(guān)復(fù)合物中存在這些蛋白(圖2B)。除了先前報道的與SIRT1相互作用的蛋白外,新發(fā)現(xiàn)的SIRT1相關(guān)蛋白DDB1表明,SIRT1可能與CRL4B復(fù)合物的組成部分CUL4B和ROC1在物理上相互作用(圖2B)。為了進(jìn)一步證實SIRT1和CRL4B復(fù)合物在體外的相互作用,我們在四種胰腺癌細(xì)胞株中進(jìn)行了co-IP檢測,結(jié)果顯示SIRT1與CRL4B復(fù)合物共免疫沉淀(圖2C)。為了確定SIRT1/CRL4B復(fù)合物的存在,我們使用FPLC對核蛋白進(jìn)行了蛋白分離實驗。Western blotting顯示,SIRT1的洗脫模式與CRL4B組分的洗脫模式大部分重疊(圖2D),支持了SIRT1和CRL4B復(fù)合物可能在體內(nèi)有功能合作的論點。接下來,GST下拉分析結(jié)果顯示SIRT1直接與CUL4B和DDB1相互作用(圖2E)。此外,SIRT1的N-terminal負(fù)責(zé)CUL4B的結(jié)合,而C-terminal是DDB1的結(jié)合所必需的(圖2F(a))。結(jié)果還表明,CUL4B NEDD8結(jié)構(gòu)域直接參與與SIRT1相互作用(圖2F(b))。CUL4B類泛素化位點先前已報道在氨基酸836-843上。結(jié)果顯示,具有泛素化位點缺失的CUL4B NEDD8結(jié)構(gòu)域仍然直接與SIRT1相互作用(圖2F(c)),表明SIRT1與CUL4B的相互作用不依賴于類泛素化修飾。GST下拉分析表明,DDB1 BPC結(jié)構(gòu)域與SIRT1相互作用(圖2F(d))。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步支持了SIRT1與CRL4B復(fù)合物之間的特異性相互作用,而且揭示了SIRT1/CRL4B復(fù)合物形成的分子機(jī)制(圖2G)。
為了進(jìn)一步探索SIRT1和CUL4B之間的功能關(guān)系,我們研究了SIRT1或CUL4B是否會改變H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac和H2AK119ub1的整體水平。Western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)SIRT1降低了H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac,而顯著增加了H2AK119ub1(圖2H)。在PAN1細(xì)胞中敲除SIRT1,這些組蛋白位點表現(xiàn)出相反的趨勢。CUL4B過表達(dá)顯著增加H2AK119ub1,降低H4K16ac;CUL4B下調(diào)后,H2AK119ub1顯著降低,H3K9ac、H3K14ac和H4K16ac略有升高(圖2H)。這些結(jié)果提供了支持SIRT1和CRL4B復(fù)合物相互作用的特定機(jī)制的證據(jù);從而確定SIRT1和CUL4B的功能連通性。
3)SIRT1/CRL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄靶點的全基因組識別
接下來,我們使用ChIP-seq分析全基因組SIRT1/CRL4B復(fù)合物轉(zhuǎn)錄靶點。我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B特異性結(jié)合峰分別為10455和12591(圖3A)。此外,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1和CUL4B具有相似的結(jié)合基元(圖3B),這支持了它們在物理上相互作用并在功能上相互連接的觀點。然后,對SIRT1(1560個基因)和CUL4B(2369個基因)的DNA啟動子序列進(jìn)行重疊分析;這些啟動子代表了SIRT1/CRL4B復(fù)合物的共同靶點(圖3C)。我們鑒定了288個SIRT1和CUL4B特異性啟動子,并將它們分為不同的細(xì)胞信號通路,包括Rap1、AMPK、FoxO、Hippo、細(xì)胞周期、黏附、以及調(diào)控干細(xì)胞的多能性,這在腫瘤的形成和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用(圖3D)。qChIP分析顯示,SIRT1和CUL4B對FOXO3、GRHL3、NAV3、AF6、PRDM2、MOB1A、DLG1、CTNNA1和CTNNA3等經(jīng)典通路基因的啟動子具有強(qiáng)富集作用(圖3E)。RT-qPCR進(jìn)一步顯示,SIRT1或CUL4B敲低后,PANC-1細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄水平部分升高(圖3F)。ChIP實驗表明,SIRT1或CUL4B缺失的PANC-1細(xì)胞中,SIRT1和CUL4B向其靶啟動子的募集均減少(圖3G和H)。因此,SIRT1和CRL4B可能相互促進(jìn)對方在靶啟動子上的募集或穩(wěn)定,形成抑制靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。
4)通過SIRT1/CRL4B復(fù)合物調(diào)控FOXO3和GRHL3
我們評估了靶向SIRT1和CUL4B mRNA的慢病毒shRNA(圖4A),選擇最有效的進(jìn)行接下來的實驗。FOXO3是一個成熟的腫瘤抑制基因,參與多種細(xì)胞過程;GRHL3是分化所必需的,并具有抑制腫瘤的作用。因此,我們研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物對FOXO3和GRHL3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。SIRT1或CUL4B敲低導(dǎo)致PANC-1(圖4B和C)和AsPC-1(圖4D和E)細(xì)胞中FOXO3和GRHL3的表達(dá)增加。在PANC-1細(xì)胞中,通過ChIP或ChIP/Re-ChIP實驗進(jìn)一步研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物介導(dǎo)的FOXO3和GRHL3的調(diào)控(圖4F)。這些結(jié)果支持了SIRT1和CRL4B復(fù)合物作為一個蛋白復(fù)合物占據(jù)FOXO3和GRHL3啟動子。此外,qChIP分析表明,敲除SIRT1、CUL4B或DDB1的表達(dá)導(dǎo)致FOXO3和GRHL3啟動子相應(yīng)蛋白的募集顯著減少(圖4 G)。SIRT1下調(diào)不僅導(dǎo)致FOXO3和GRHL3啟動子H3K9ac、H3K14ac、H4K16ac升高,還顯著降低了H2AK119ub1水平。CUL4B或DDB1基因敲低也得到類似的結(jié)果,表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物作為一個整體與FOXO3和GRHL3啟動子結(jié)合,催化組蛋白的泛素化和去乙?;?/span>(圖4G)。這進(jìn)一步證實了SIRT1和CRL4B復(fù)合物通過一組靶基因(如FOXO3和GRHL3)的轉(zhuǎn)錄抑制在功能上存在關(guān)聯(lián)。
5)SIRT1和CUL4B共同促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、自噬和轉(zhuǎn)移
我們研究了SIRT1/CRL4B復(fù)合物在胰腺癌細(xì)胞增殖、自噬和轉(zhuǎn)移中的作用。生長曲線分析顯示,SIRT1和CUL4B促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖5A)。EdU結(jié)果顯示,在EdU標(biāo)記的細(xì)胞中,SIRT1或CUL4B過表達(dá)與明顯的百分比增加相關(guān),而SIRT1或CUL4B敲低的細(xì)胞顯示這些細(xì)胞的百分比要低得多(圖5B)。這表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物在體外促進(jìn)了胰腺細(xì)胞的增殖。
有報道稱自噬阻斷降低了胰腺CSC活性。因此,我們接下來研究了SIRT1和CUL4B在自噬中的作用。在EGFP-LC3 PANC-1細(xì)胞中,SIRT1或CUL4B過表達(dá)增加LC3斑點(圖5C)。在mCherryGFP-LC3 PANC-1細(xì)胞中,SIRT1或CUL4B過表達(dá)顯示GFP-/mCherry+(紅色斑點)自噬溶酶體增加,在較小程度上,GFP+/mCherry+(黃色斑點)吞噬體/自溶噬體增加(圖5D)。接下來,用LysoTracker Red對溶酶體隔室進(jìn)行染色,顯示過表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1細(xì)胞中溶酶體區(qū)域擴(kuò)大(圖5E)。此外,流式細(xì)胞術(shù)顯示過表達(dá)SIRT1或CUL4B的細(xì)胞中LysoTracker+細(xì)胞含量增加(圖5F)。我們使用自噬體和溶酶體融合抑制劑巴菲霉素A1 (BafA1)進(jìn)行自噬通量分析。經(jīng)過BafA1處理后,SIRT1和CUL4B的增加與LC3-II的積累相關(guān)。western blot分析也證實了SIRT1和CUL4B基因下調(diào)導(dǎo)致的自噬通量缺陷(圖5G和圖S3C)。這些結(jié)果表明,SIRT1或CUL4B過表達(dá)不僅增強(qiáng)了自噬通量,還增強(qiáng)了溶酶體功能。
接下來,western blot顯示上皮標(biāo)記物,如α-和γ-catenin表達(dá)減少,而間質(zhì)標(biāo)記物,包括N-cadherin和Vimentin,在SIRT1或CUL4B過表達(dá)時增加(圖5H)。在PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中單個敲除SIRT1或CUL4B時,這些EMT標(biāo)記物表現(xiàn)出相反的趨勢。此外,在PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中進(jìn)行transwell侵襲檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)SIRT1或CUL4B導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增加超過兩倍,而敲除SIRT1或CUL4B則導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力明顯降低(圖5I)。下調(diào)CUL4B或SIRT1后,過表達(dá)SIRT1或CUL4B的作用減弱,同時下調(diào)SIRT1和CUL4B后,細(xì)胞侵襲能力明顯減弱(圖5I)。在PANC-1細(xì)胞中敲低SIRT1或CUL4B降低了細(xì)胞侵襲潛能,這部分可通過共同敲低FOXO3或GRHL3來挽救,表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物可通過抑制FOXO3和GRHL3來促進(jìn)胰腺癌侵襲(圖5J)。這些結(jié)果表明,SIRT1/CRL4B復(fù)合物促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲潛能,部分通過抑制FOXO3和GRHL3。
6)SIRT1和CUL4B促進(jìn)胰腺癌干細(xì)胞特性
我們研究了SIRT1和CUL4B是否影響胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型。在穩(wěn)定表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中,干細(xì)胞標(biāo)記物均增加(圖6A)。為了進(jìn)一步闡明SIRT1和CUL4B是否促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞向CSCs的發(fā)展,我們分析了SIRT1和CUL4B對球體形成的影響。在穩(wěn)定表達(dá)SIRT1或CUL4B的PANC-1和AsPC-1細(xì)胞中,球的數(shù)量和大小增加,而下調(diào)SIRT1或CUL4B后,球的數(shù)量和大小減少(圖6B)。接下來,流式細(xì)胞術(shù)顯示過表達(dá)SIRT1和CUL4B后CD133+細(xì)胞數(shù)量增加,這一效應(yīng)在抑制CUL4B和SIRT1后部分被挽救(圖6C)。這些結(jié)果表明SIRT1/CRL4B復(fù)合物促進(jìn)胰腺CSC特性。為了進(jìn)一步證實SIRT1在體內(nèi)靶向胰腺CSC群體,我們建立了小鼠異種移植模型。注射4周后,通過生物發(fā)光觀察移植細(xì)胞的生長情況(圖6D)。穩(wěn)定表達(dá)SIRT1的細(xì)胞顯著增加了腫瘤起始能力(圖6E)。SIRT1過表達(dá)組與對照組相比CSC頻率顯著增加(圖6F)。此外,SIRT1顯著促進(jìn)胰腺腫瘤的生長(圖6G)。這表明SIRT1可以顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞性,從而促進(jìn)腫瘤移植瘤的生長。與腫瘤生長加速一致,SIRT1過表達(dá)組Ki67陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組(圖6H)。我們利用RNA-seq研究了SIRT1過表達(dá)的全基因組效應(yīng)。與對照組相比,我們在SIRT1過表達(dá)的腫瘤樣本中共發(fā)現(xiàn)了2506個上調(diào)基因和2229個下調(diào)基因(圖6I)。KEGG富集分析結(jié)果顯示,這些差異表達(dá)的基因不僅參與病灶黏附、Wnt、Hippo、細(xì)胞周期等與腫瘤生長和干性密切相關(guān)的途徑,而且在與自噬相關(guān)的吞噬小體和溶酶體途徑中富集(圖6J)。接下來,我們選擇了12個已知的腫瘤抑制因子與癌癥發(fā)展有關(guān)的基因,包括GRHL3、NAV3、AXIN2、FOXP1、WISP3、SPDEF、RASSF1、PTPRG、IGFBP4、FHL1、FEZ1和DUSP4,并通過RT-qPCR驗證了它們在SIRT1過表達(dá)的腫瘤樣本中的表達(dá)降低(圖6K)。這些結(jié)果表明,SIRT1參與調(diào)節(jié)與腫瘤生長、自噬和干細(xì)胞形成密切相關(guān)的各種通路,并促進(jìn)胰腺CSC的發(fā)展
7)SIRT1和CUL4B在多種癌癥中表達(dá)上調(diào),是一種潛在的癌癥生物標(biāo)志物
我們收集了86例胰腺癌患者的樣本,通過免疫組化染色進(jìn)行組織微陣列,檢測SIRT1、CUL4B和FOXO3的表達(dá)情況(圖7A)。SIRT1和CUL4B在腫瘤中顯著上調(diào),其表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級呈正相關(guān),FOXO3表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)(圖7B)。為了研究SIRT1和CUL4B的影響是否可以擴(kuò)展到更廣泛的癌癥范圍,我們收集了幾個癌癥樣本,對其進(jìn)行組織微陣列和免疫組化染色來檢測SIRT1和CUL4B的表達(dá)(圖7C)。結(jié)果顯示,除胰腺癌外,SIRT1和CUL4B在食管癌、胃癌、直腸癌、肝癌、肺癌中與癌旁正常組織相比也顯著上調(diào)(圖7D)??傊?,我們的分析表明SIRT1和CUL4B在多種癌癥中上調(diào),是潛在的癌癥生物標(biāo)志物。
結(jié)論: SIRT1和CRL4B作為一個功能單元相互作用和合作,提供了一種新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式,同時也為染色質(zhì)重構(gòu)中組蛋白去乙?;头核鼗峁┝诵碌姆肿踊A(chǔ)。此外,SIRT1/CRL4B復(fù)合物有助于腫瘤抑制的表觀遺傳學(xué)沉默,也在胰腺癌的腫瘤發(fā)生和調(diào)節(jié)CSCs的特性中發(fā)揮重要作用。因此,SIRT1和CUL4B是潛在的致癌基因和生物標(biāo)志物,可能作為腫瘤治療的靶點。