PARP抑制劑通過抑制SLC7A11促進鐵死亡，并與鐵死亡誘導劑協(xié)同作用于BRCA野生型卵巢癌

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中死亡率居首位，PARP1是癌癥治療的重要靶點。其中藥物抑制PARP是治療晚期卵巢癌的一種有前途的治療策略。PARP抑制癌細胞的作用機制尚不完全清楚，同時是否能通過直接與DNA損傷相關的機制來抑制腫瘤仍不清楚。近日，有作者證明了抑制PARP通過抑制SLC7A11促進鐵死亡（ferroptosis），ferroptosis與PARP抑制相結(jié)合，并提示PARP抑制劑與FINs聯(lián)合治療BRCA型卵巢癌。該研究發(fā)表在《Redox biology》，IF為11.799。

技術路線：

主要結(jié)果：

1. 抑制PARP促進卵巢癌細胞的鐵死亡

PARP抑制通常被認為是通過抑制DNA修復和促進細胞凋亡來誘導癌細胞死亡，但目前尚不清楚抑制PARP對卵巢癌細胞的毒性機制是否為ferropsis。因此作者首先證明PARP抑制與鐵死亡的相關性。使用PARP的抑制劑olaparib（奧拉帕尼）誘導了卵巢細胞系的脂質(zhì)過氧化，同時使用鐵死亡抑制劑ferrostatin-1能消除這個影響（圖1A），另外奧拉帕尼顯著誘導了PTGS2（一種ferropsis的遺傳標志）的表達。

為了了解ferroptosis在奧拉帕尼介導的抗癌作用中的潛在作用，作者研究了ferroptosis抑制劑ferrostatin-1和凋亡抑制劑Z-VAD-fmk對奧拉帕尼處理的細胞克隆生存的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼治療抑制了克隆基因的存活，而奧拉帕尼和ferrostatin-1聯(lián)合治療部分恢復了A2780和HEY細胞的存活(圖1C和D)。在不同濃度奧拉帕尼的作用下，ferrostatin-1處理提高了A2780和HEY細胞的細胞活力(圖1E)，這表明，ferrostatin-1對PARP抑制劑奧拉帕尼的療效起部分作用。BODIPY 581/591C11染色顯示，在基礎條件下，PARP1缺失(sgPARP1)促進了脂質(zhì)過氧化，并顯著增強了erastin(ferroptosis激活劑)誘導的細胞的脂質(zhì)過氧化(圖1F)。在HEY和A2780細胞中，PARP1的缺失顯著增強了erastin誘導的 ferroptosis(圖1G，H)，表明PARP1可能在ferroptosis通路中起到關鍵的中介作用?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)強烈表明，PARP抑制促進了ferroptosis，而ferroptosis是PARP抑制劑奧拉帕尼在卵巢癌細胞中發(fā)揮作用的關鍵。

圖1. 抑制PARP促進卵巢癌細胞的鐵死亡

2. 抑制PARP以p53依賴的方式抑制SLC7A11的表達

為了探討抑制PARP促進ferroptosis的機制，通過基因集富集分析(GSEA)評估TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)庫中PARP1調(diào)控基因富集的ferroptosis相關生物學過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PARP1調(diào)控的基因中，氨基酸跨質(zhì)膜運輸和溶質(zhì)載體(SLC)介導的跨膜運輸?shù)然驑擞涳@著富集(圖2A)。這兩個基因集的整合鑒定出38個基因，這些基因促進谷胱甘肽(GSH)生物合成，抑制脂質(zhì)過氧化和ferroptosis (圖2B)，并發(fā)現(xiàn)PARP1和SLC7A11在卵巢癌組織中的表達均明顯高于正常卵巢組織(圖2C)。進一步Pearson相關系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)PARP1與SLC7A11在卵巢癌及正常組織中的表達水平呈正相關(圖2D)。另外，PARP1還與一些其他的ferroptosis保護劑相關，如卵巢癌中的AIFM2(也稱為FSP1)、CBS和HSPB1(圖2E)。在PARP抑制下，與鐵蛋白相關基因表達沒有顯著變化(圖2F)。與mRNA表達一致的是，在HEY和A2780細胞中，奧拉帕尼顯著降低了SLC7A11蛋白水平(圖2G)。同時，奧拉帕尼顯著上調(diào)了p53的表達，而沒有顯著影響其他SLC7A11調(diào)控因子的水平，如BAP1和ATF3(圖2H)。NRF2是促進SLC7A11轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，由于奧拉帕尼處理引起的脅迫而上調(diào)(圖2H)。進一步富集途徑分析顯示PARP1與p53降解顯著正相關(圖2I)。

接下來，作者確定了PARP1基因消融對SLC7A11和p53表達的影響。PARP1敲除明顯降低HEY細胞中SLC7A11蛋白水平，誘導p53表達(圖2J)。在對PARP1進行遺傳消融的HEY細胞中并未發(fā)現(xiàn)GPX4上調(diào)(圖2J)，這表明奧拉帕尼處理后HEY細胞中GPX4的誘導可能是對氧化應激的適應性反應，因為該細胞系中GPX4的基礎水平較低(圖2G)。另外，作者觀察到奧拉帕尼在SKOV3細胞中降低PARP1蛋白水平而不影響SLC7A11蛋白水平(圖2K)。同樣，PARP1的缺失也無法抑制SKOV3細胞中SLC7A11的表達(圖2L)。為了進一步確定PARP抑制是否以p53依賴的方式抑制SLC7A11的表達，通過CRISPR/Cas9在野生型p53表達的HEY細胞中敲除p53。我們發(fā)現(xiàn)，與p53缺陷的SKOV3細胞一致，奧拉帕尼在對照組細胞中下調(diào)SLC7A11的mRNA和蛋白表達，而在p53 敲除細胞中沒有下調(diào)(圖2M, N)。綜上所述，結(jié)果表明，PARP抑制主要通過上調(diào)卵巢癌細胞中的p53來抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄。

圖2 抑制PARP以p53依賴的方式抑制SLC7A11的表達

3. PARP抑制劑奧拉帕尼通過抑制SLC7A11介導的谷胱甘肽合成部分促進ferroptosis

接下來，從功能上將SLC7A11與奧拉帕尼介導的ferroptosis和卵巢癌的療效聯(lián)系起來。首先研究了奧拉帕尼抑制的SLC7A11表達是否與卵巢癌細胞中胱氨酸攝取和谷胱甘肽合成的減少相關。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧拉帕尼治療抑制了胱氨酸的攝取，并顯著降低了谷胱甘肽水平(圖3A)，另外，奧拉帕尼降低了對照細胞中谷胱甘肽水平并促進了脂質(zhì)過氧化，而SLC7A11的過表達明顯恢復了谷胱甘肽水平并減輕了奧拉帕尼誘導的脂質(zhì)過氧化(圖3B-D)。在奧拉帕尼處理的A2780細胞中，SLC7A11過表達顯著恢復了細胞活力，達到與ferrostatin-1處理相似的水平(圖3E)。另外，與SLC7A11過表達類似，NAC處理（n -乙酰半胱氨酸）增加了基礎和奧拉帕尼處理條件下A2780細胞的GSH水平，并在奧拉帕尼處理下部分恢復了A2780細胞的克隆存活(圖3F和G)。提示SLC7A11促進GSH生物合成是奧拉帕尼誘導ferroptosis的重要機制。

接下來，確定p53缺失是否在奧拉帕尼誘導的ferroptosis中具有與SLC7A11過表達類似的作用。用shRNA敲除HEY細胞中的SLC7A11(圖3H)，在奧拉帕尼處理的HEY細胞中，SLC7A11敲低(sh-SLC7A11)進一步降低了奧拉帕尼消耗的GSH水平，并顯著降低了細胞活力(圖3I和J)，表明SLC7A11敲低使細胞對奧拉帕尼更加敏感。與NAC處理相比，L -丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)處理HEY細胞進一步增強了奧拉帕尼對GSH生物合成的抑制，并顯著地使細胞對奧拉帕尼敏感(圖3K和L)，這與SLC7A11基因敲低一致。總之，這些結(jié)果表明，PARP抑制劑奧拉帕尼至少部分通過抑制SLC7A11介導的谷胱甘肽合成來促進ferroptosis，而且奧拉帕尼的功效可以通過基因改變SLC7A11的表達或藥理上調(diào)節(jié)卵巢癌細胞中谷胱甘肽的水平來調(diào)節(jié)。

圖3 奧拉帕尼通過抑制SLC7A11介導的谷胱甘肽合成部分促進ferroptosis

4. 奧拉帕尼的DNA損傷反應與ferroptosis介導的療效無關

奧拉帕尼介導的細胞致死機制主要來源于抑制PARP的催化活性，阻止DNA單鏈斷裂修復，促進DNA雙鏈斷裂。但是上述數(shù)據(jù)提示奧拉帕尼可誘導卵巢癌細胞發(fā)生ferroptosis，而ferroptosis是奧拉帕尼介導的抗癌作用的一部分。因此作者研究奧拉帕尼治療后，ferroptosis和DNA損傷反應之間是否存在串擾。免疫熒光分析顯示，在A2780細胞中，奧拉帕尼處理后磷酸化的(γ) H2AX位點(DNA損傷的標記)顯著增加，而ferrostatin-1處理雖然挽救了奧拉帕尼處理后的細胞存活(圖1D和E)，但沒有影響奧拉帕尼處理或未處理細胞中觀察到的γH2AX聚焦的數(shù)量(圖4A和B)。同樣地，western blotting顯示奧拉帕尼可誘導H2AX和其他DNA修復途徑的調(diào)控因子磷酸化，包括ATM和Chk2，并增加cleaved caspase-3(凋亡標記)的表達，然而，無論奧拉帕尼處理與否，ferrostatin-1處理對A2780細胞中的這些標記物均無明顯影響(圖4C)，表明奧拉帕尼處理后，鐵抑制對DNA損傷反應及其下游效應-細胞凋亡沒有顯著影響。同時奧拉帕尼增加了γH2AX聚焦位點的數(shù)量，并誘導了對照細胞中H2AX的磷酸化，而SLC7A11敲低并沒有進一步改變這兩個位點(圖4D-F)?？傊@些結(jié)果表明，DNA損傷或修復既不參與ferroptosis擾動介導的奧拉帕尼耐藥，也不參與ferroptosis增強介導的奧拉帕尼敏化。

圖4 奧拉帕尼的DNA損傷反應與ferroptosis介導的療效無關

5. FINs協(xié)同使精通BRCA的卵巢癌細胞對奧拉帕尼敏感

由于野生型BRCA可以修復奧拉帕尼誘導的DNA損傷并導致奧拉帕尼帕林耐藥，因此奧拉帕尼未能為精通BRCA的卵巢癌提供實質(zhì)性的臨床益處。由于SLC7A11的敲除增強了奧拉帕尼帕利的療效（圖3J），我們首先檢查了靶向SLC7A11的erastin是否會在BRCA野生型卵巢癌細胞中產(chǎn)生類似的效果。BODIPY 581/591C11染色顯示，在BRCA野生型HEY和A2780細胞中，erastin不僅顯著觸發(fā)脂質(zhì)過氧化，而且協(xié)同增強了奧拉帕尼誘導的脂質(zhì)過氧化（圖5A）。HEY和A2780細胞對奧拉帕尼相對耐藥，而erastin處理降低了細胞活力，使HEY和A2780細胞對奧拉帕尼顯著敏感(圖5B)。在指示濃度下，在HEY和A2780細胞中，FINs和奧拉帕尼的聯(lián)合指標均小于1(圖5C)，提示erastin與奧拉帕尼協(xié)同作用。我們在臨床常用的SLC7A11抑制劑磺胺吡啶治療中也得到了類似的觀察結(jié)果，即磺胺吡啶促進奧拉帕尼誘導的脂質(zhì)過氧化，并協(xié)同作用使HEY細胞對奧拉帕尼致敏(圖5D-F)。緊接著作者證明RSL3(失活GPX4)處理增強了奧拉帕尼誘導的HEY細胞脂質(zhì)過氧化，并以協(xié)同的方式顯著使HEY細胞對奧拉帕尼敏感(圖5G-I)。總之，在沒有p53缺陷的BRCA野生型卵巢癌細胞對奧拉帕尼具有協(xié)同敏感性，這表明奧拉帕尼的應用可能擴展到BRCA野生型卵巢癌與FINs聯(lián)合使用。

圖5 FINs協(xié)同使精通BRCA的卵巢癌細胞對奧拉帕尼敏感

6. 體內(nèi)ferroptosis與奧拉帕尼介導的腫瘤抑制相關

為了證實ferroptosis與奧拉帕尼體內(nèi)療效的潛在相關性，我們將A2780細胞接種到裸鼠中，并給小鼠注射奧拉帕尼、liproxstatin-1 (一種穩(wěn)定的ferroptosis拮抗劑)，或兩者同時使用(圖6A)。與體外實驗結(jié)果一致，奧拉帕尼顯著降低了腫瘤的生長。單獨使用liproxstatin-1治療并不影響腫瘤生長，但奧拉帕尼的療效部分消失(圖6B-D)，提示奧拉帕尼誘導腫瘤發(fā)生ferroptosis，抑制ferroptosis導致體內(nèi)奧拉帕尼耐藥。

為了驗證在體內(nèi)使用FINs增強ferroptosis是否能使BRCA卵巢癌對奧拉帕尼敏感，我們將HEY細胞接種到裸鼠中，并同時給小鼠使用奧拉帕尼、磺胺吡啶或兩種藥物(圖6E)。雖然單獨使用磺胺吡啶并沒有顯著降低腫瘤生長或延長小鼠存活率，但它確實顯著提高了這些HEY源性腫瘤對奧拉帕尼的敏感性，導致了有效的腫瘤抑制和生存益處(圖6F, G)。值得注意的是，與其他治療相比，奧拉帕尼聯(lián)合磺胺吡啶的小鼠體重并沒有明顯下降(圖6H)，提示奧拉帕尼聯(lián)合磺胺吡啶的毒性在體內(nèi)是耐受的?？偟膩碚f，奧拉帕尼和磺胺吡啶聯(lián)合治療BRCA野生型卵巢癌是一種有前景的治療策略。

圖6 體內(nèi)ferroptosis與奧拉帕尼介導的腫瘤抑制相關

總結(jié)：

該研究揭示了PARP抑制顯著促進了卵巢癌中的ferroptosis，表明ferroptosis與抑制PARP介導的抗腫瘤作用有關，并證實了FINs協(xié)同使BRCA功能良好的卵巢癌細胞對PARP抑制劑奧拉帕尼敏感。為PARP抑制劑在BRCA型卵巢癌中的應用提供了一種有前景的治療策略。

參考文獻：

Hong T, Lei G, Chen X, Li H, Zhang X, Wu N, Zhao Y, Zhang Y, Wang J. PARP inhibition promotes ferroptosis via repressing SLC7A11 and synergizes with ferroptosis inducers in BRCA-proficient ovarian cancer. Redox Biol. 2021, 42:101928. doi: 10.1016/j.redox.2021.101928.