促癌小分子的新成員——LncRNA ITGB8-AS1

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-08-24
本文發(fā)現(xiàn)lncRNA ITGB8-AS1在CRC中高表達(dá)起到促癌作用,并且可能是潛在的治療靶點(diǎn)......


LncRNA在結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但大多數(shù)lncRNACRC中的功能及其分子機(jī)制尚不清楚。本文發(fā)現(xiàn)lncRNA ITGB8-AS1CRC中高表達(dá)起到促癌作用,并且可能是潛在的治療靶點(diǎn)。該文于20218月發(fā)表于《Molecular TherapyIF:11.454雜志上。


技術(shù)路線:




主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

1ITGB8-AS1CRC生長和遷移所必須的

作者在HCT116DLD-1細(xì)胞系中敲除ITGB8-AS1后,發(fā)現(xiàn)兩個細(xì)胞系的增殖和集落形成,以及細(xì)胞的遷移。在體內(nèi),敲除ITGB8-AS1后腫瘤的生長受到顯著抑制。此外,作者還構(gòu)建了ITGB8-AS1過表達(dá)載體驗(yàn)證ITGB8-AS1對腫瘤的影響,實(shí)驗(yàn)證明ITGB8-AS1CRC生長和遷移所必須的。

 

2CRCITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號通路

作者對ITGB8-AS1敲除的細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,挖掘差異表達(dá)基因,并對其進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集與Focal黏附信號通路。如圖1,作者使用WB檢測了該通路中的幾個關(guān)鍵基因,發(fā)現(xiàn)敲除ITGB8-AS1后兩個細(xì)胞系中他們的表達(dá)或磷酸化都顯著下降。這些結(jié)果表明在CRCITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號通路。


1 ITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號通路

 

3、ITGB8-AS1作為miR-33b-5plet-7d-5p/let-7d-5p的海綿調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)

為了探究ITGB8-AS1調(diào)節(jié)Focal黏附信號通路的機(jī)制,作者試圖探究ITGB8-AS1的編碼潛力。如圖2所示,和ACTB不同,多核糖體譜分析表明ITGB8-AS1富集于free-RNA組分,表明其沒有編碼能力,隨后作者使用FISH分析了ITGB8-AS1的細(xì)胞質(zhì)定位,發(fā)現(xiàn)其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。這些提示ITGB8-AS1可能以ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用。

 

2 ITGB8-AS1CRC細(xì)胞中的編碼潛能及亞細(xì)胞定位分析

 

為了驗(yàn)證ITGB8-AS1是否以ceRNA發(fā)揮作用,作者在線預(yù)測并構(gòu)建了以ITGB8-AS1為中心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后,敲除ITGB8-AS1后檢測miRNA靶向的mRNA的表達(dá),結(jié)果表明ITGA3ITGA5ITGB3的表達(dá)在兩個細(xì)胞系中都顯著下降,而過表達(dá)ITGB8-AS1后他們的表達(dá)都顯著升高(圖3)。值得一提的是ITGA3,ITGA5ITGB3都是整合素家族基因。


3 ITGB8-AS1海綿吸附miRNA調(diào)控整合素的表達(dá)

 

為了進(jìn)一步確定哪些miRNA在連接ITGB8-AS1和整合素基因中起作用,作者在HCT116細(xì)胞中進(jìn)行挽救試驗(yàn)。如圖4所示,miR-33b-5p抑制劑可以顯著挽救因ITGB8-AS1敲除導(dǎo)致的ITGA3,ITGA5ITGB3基因表達(dá)下調(diào),而其余的miRNA抑制劑則不行。此外,RIP結(jié)果表明ITGB8-AS1顯著富集于AGO2蛋白蛋白復(fù)合物中,而雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明ITGB8-AS1miR-33b-5p,以及let-7c-5p/let-7d-5p之間存在直接作用。以上表明ITGB8-AS1可以海綿吸附miR-33b-5plet-7c-5p/let-7d-5p以調(diào)節(jié)ITGA3ITGB3的表達(dá)進(jìn)而作用于CRC的進(jìn)展。圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。

 

4 ITGB8-AS1/miRNA/integrinsceRNA網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證

 

5 ITGB8-AS1海綿吸附miR-33b-5plet-7c-5p/let-7d-5p促進(jìn)CRC生長遷移

 

4、ITGB8-AS1可作為CRC的潛在診斷和預(yù)測biomarker

使用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測了ITGB8-AS1在結(jié)腸癌和直腸腺癌中的表達(dá),結(jié)果顯示ITGB8-AS1在腫瘤樣本中高表達(dá)。隨后作者檢測了14對術(shù)后CRC組織和對應(yīng)的癌旁中ITGB8-AS1的表達(dá),同樣是癌組織高于癌旁。為了探究ITGB8-AS1在液體活檢中的作用,作者檢測了7例健康對照和CRC患者血漿中ITGB8-AS1的表達(dá),得出了一樣的結(jié)果。此外,在一個獨(dú)立隊(duì)列結(jié)果中,血漿ITGB8-AS1水平與腫瘤分化顯著正相關(guān)。III期和IV期患者血漿ITGB8-AS1水平均高于I-II期患者。淋巴結(jié)受累者易出現(xiàn)高ITGB8-AS1血漿水平,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而年齡、性別、原發(fā)腫瘤位置和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移與則ITGB8-AS1的血漿水平無關(guān)。ITGB8-AS1的血漿水平還與其靶基因表達(dá)表現(xiàn)出正相關(guān)性。這些結(jié)果表明ITGB8-AS1可作為CRC的診斷和預(yù)測生物標(biāo)志物。

 

6 ITGB8-AS1可作為CRC的潛在診斷和預(yù)測biomarker

 

5ITGB8-AS1是治療CRC的潛在靶點(diǎn)

如前文所述,ITGB8-AS1CRC中上調(diào)并促進(jìn)CRC的惡性行為,這為針對該lncRNA的治療提供了理論依據(jù)。為了探索ITGB8-AS1抑制的治療潛力,針對ITGB8-AS1的反義寡核苷酸(ASO)被應(yīng)用于各種CRC臨床前模型,包括患者來源的異種移植(PDX)。如圖7a-c所示,ITGB8-AS1-ASO顯著抑制細(xì)胞的增殖和集落形成。為了驗(yàn)證在體內(nèi)靶向ITGB8-AS1的活性,進(jìn)行PDXHCT116來源的異種移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB8-AS1-ASO的抗腫瘤效率在CRC PDXHCT116細(xì)胞負(fù)荷的小鼠中都可顯著抑制腫瘤生長(圖7d-e),同樣也可以抑制腫瘤的肝轉(zhuǎn)移,并且miR-33b-5p,let-7c-5plet-7d-5p抑制劑都可以緩解ITGB8-AS1-ASO的抗腫瘤效果(圖7f-g)。因此,ITGB8-AS1可以作為靶向治療CRC的新靶點(diǎn),而ASO似乎是一種有潛力的治療方式。

 

7 ITGB8-AS1CRC潛在的治療靶點(diǎn)

 

8本研究的機(jī)制模型圖


ITGB8-AS1通過吸附miR-33b-5p來調(diào)節(jié)ITGA3的表達(dá),同時(shí)通過let-7c-5plet-7d-5p來調(diào)節(jié)ITGB3的表達(dá),然后激活整合素介導(dǎo)的Focal粘附信號。ITGB8-AS1可作為CRC患者新的治療靶點(diǎn)和循環(huán)生物標(biāo)志物。

 

參考文獻(xiàn):

Lin X, Zhuang S, Chen X, Du J, Zhong L, Ding J, Wang L, Yi J, Hu G, Tang G, Luo X, Liu W, Ye F, LncRNA ITGB8-AS1 functions as a ceRNA to promote colorectal cancer growth and migration through integrin-mediated focal adhesion signaling, Molecular Therapy (2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.08.011.