與癌癥外泌體結合的腫瘤微環(huán)境細胞因子決定細胞因子受體表達細胞的攝取和生物分布

轉移是癌細胞擴散到遠端部位的過程，約占癌癥死亡率的90%。據報道，轉移起始腫瘤細胞顯示了基本的內在特征，如細胞可塑性、遷移和侵襲能力增強、抗凋亡和免疫編輯。此外，原發(fā)性腫瘤可以釋放細胞因子、生長因子和其他蛋白質因子，這些因子能夠為循環(huán)癌細胞的到來啟動遠處組織，從而創(chuàng)造一個能夠支持轉移性生長的轉移前生態(tài)位。癌細胞分泌囊泡，特別是外泌體，是已知的轉移前生態(tài)位形成的基本介質。腫瘤細胞分泌的外泌體顯著促進細胞間通訊和隨后的腫瘤微環(huán)境重新編程。

今天我們講一篇關于腫瘤外泌體分布吸收重塑免疫微環(huán)境的文章，該文章題名為Tumor microenvironmental cytokines bound to cancer exosomes determine uptake by cytokine receptor-expressing cells and biodistribution（IF=14.9），發(fā)表在Nature Communications期刊。

腫瘤微環(huán)境細胞因子影響器官特異性外泌體積累并促進轉移

通過分析從健康受試者和乳腺癌（BC）患者的血漿中分離出的外顯體，確定了許多與外泌體共同分離的細胞因子和生長因子，在BC患者來源的外泌體上發(fā)現了更豐富和多樣性。特別是，當通過 ELISA 評估時，證實在來自 BC 患者的外泌體樣品中更高水平的CCL2和IL-6表達。形成鮮明對比的是，從體外培養(yǎng)的 EO771 BC 細胞中分離出的純外泌體在很大程度上缺乏細胞因子和生長因子。為了評估外泌體在細胞因子環(huán)境中的行為，從同基因、原位 EO771 癌腫塊中獲得了外泌體耗盡的腫瘤間質液 (TIF)，其顯示了一系列細胞因子和生長因子，包括CCL2和IL-6。將EO771細胞衍生的外泌體添加到這種外泌體耗盡的TIF中，隨后重新分離外泌體以去除游離的未結合的可溶性因子，顯示出特定外泌體/細胞因子關聯的富集。例如，CCL2、IL-6 和 CXCL1 很容易共同分離，而 GM-CSF 則無法檢測到。評估小鼠中與TIF衍生細胞因子綴合的EO771外泌體的行為，我們發(fā)現 TIF 綴合的外泌體以顯著高于對照外泌體的豐度保留在各個器官中并導致白細胞攝取增加。幾種免疫細胞譜系，包括 NK 細胞、巨噬細胞和單核細胞和粒細胞髓源性抑制細胞 (mMDSCs; gMDSCs )在肝臟、脾臟和肺中，與未結合的外泌體相比，TIF 外泌體的外泌體攝取量更高。

有趣的是，重復注射 TIF-外泌體改變了肺的免疫細胞組成有趣的是，重復注射 TIF-外泌體改變了肺的免疫細胞組成、脾和肝臟。這些改變包括：雙肺 NK 細胞減少和脾臟；肺中 gMDSCs 的增加; 肝臟中樹突狀細胞（DC）的頻率降低；和的Ly6C的更高的頻率-巨噬細胞，將其報道與免疫應答相關的和肝。

轉移前生態(tài)位被認為是循環(huán)癌細胞粘附和生長的允許環(huán)境，因此通過重復注射先前與 TIF 孵育的外泌體，然后注射同基因癌細胞來誘導轉移前生態(tài)位形成。?與未結合的外泌體相比，用 TIF 結合的外泌體對小鼠進行調理后顯著（p < 0.05）增加了肺中的轉移形成。總而言之，這些數據表明腫瘤微環(huán)境中的細胞因子能夠與癌癥衍生的外泌體相關聯，從而引起遠端器官免疫景觀的變化，并隨后增加轉移負擔。

細胞因子通過蛋白聚糖的 GAG 側鏈與癌癥衍生的外泌體的外表面結合

為了評估細胞因子與癌癥衍生的外泌體關聯背后的機制，評估了細胞因子是位于外泌體內還是與外泌體外膜結合。為了研究它們的亞外泌體定位，我們添加了重組人或小鼠 CCL2 和 IL-6，這兩種細胞因子都存在于血漿外泌體分離物和TIF中，用于兩種人和兩種鼠癌細胞系衍生的外泌體。孵育后，通過重新純化外泌體去除未結合的細胞因子。我們確實觀察到兩種 CCL2 的濃度依賴性增加和 IL-6在這些環(huán)境中的外泌體分離物中。值得注意的是，CCL2 與鼠 PyMT 細胞衍生的外泌體的結合相對低于所有其他設置。進一步用蛋白酶 K 處理 CCL2 結合的 BC 外泌體，其濃度可導致外膜蛋白（如 CD9）降解，但不會降解囊泡內 HSP70，確認破壞僅限于外泌體表面。用蛋白酶 K 處理 BC 外泌體的表面表示大部分 CCL2 位于外泌體外膜上。此外，在裂解的囊泡和完整的囊泡之間未觀察到 CCL2 含量的顯著差異，表明在這種情況下，囊內細胞因子對總外泌體 CCL2 水平的貢獻很小。我們通過CCL2溫育后的外泌體的表面分析進一步證實了這些結果表面增強拉曼光譜（SERS），其檢測從膜蛋白上的外來體分子指紋。與沒有添加細胞因子的外泌體相比，與 CCL2 預偶聯的 BC 外泌體在幾個波段顯示出不同的光譜強度。然后應用主成分分析 (PCA) 來識別 CCL2 偶聯外泌體的主要光譜模式。與 CCL2 結合的外泌體與非結合的外泌體可以清楚地區(qū)分，它們的光譜主要繪制在主成分 1 (PC1) 的正側。SERS 僅在非?？拷F金屬基底的地方檢測拉曼光譜，表明大多數可檢測的 CCL2 信號來自囊泡表面。此外，通過將 PC1 加載數據與單獨重組 CCL2 的特征拉曼信號進行比較，我們觀察到 PC1 中有助于 CCL2-外泌體分布的正峰表現出與 CCL2 信號相似的模式，尤其是在 1004 和 1362 cm -1 附近。這些觀察結果表明外泌體樣品之間的差異確實是由來自 CCL2 的 SERS 信號引起的。

對于我們檢測到的與血漿外泌體相關的大多數細胞因子，BC 外泌體的蛋白質組學評估并未識別出同源受體。然而，分析我們的質譜數據，我們發(fā)現了大量的硫酸乙酰肝素 (HS) 和硫酸軟骨素 (CS) 蛋白聚糖，包括 CD44、HSPG2、glypican-1（GPC -1）、多聚糖（VCAN）和 syndecan-1（SDC1），在 BC 外泌體中。有趣的是，兩種鼠 BC 細胞來源的 EO771 和 PyMT 外泌體的蛋白多糖譜非常不同。定量地，ELISA 分析顯示 MDA-MB-231 細胞衍生的外泌體表現出與 EO771 相似的蛋白聚糖譜。GAG的存在于蛋白聚糖已顯示出結合細胞因子在不同細胞背景。因此，我們評估了這種結合在外泌體環(huán)境中是否也可能存在，并表明 versican、syndecan-1 和 CD44，以及 HSPG2，與外泌體結合的 CCL2 共沉淀。此外，添加分別催化蛋白聚糖的 HS 和 CS 鏈降解的肝素酶 III (HepIII) 和軟骨素酶 ABC (ChABC) 裂解酶，減少了 CCL2 與外泌體的結合?？傮w而言，這些數據表明細胞外細胞因子可以通過蛋白聚糖的外泌體表面 GAG 側鏈與癌細胞分泌的外泌體結合。

細胞因子結合改變外泌體的生物分布和細胞譜系特異性攝取

為了確定上述觀察到的 TIF 偶聯外泌體分布改變的機制，將 CCL2 偶聯、熒光標記的 EO771 BC 細胞衍生的外泌體靜脈注射到同基因小鼠中。各種器官（包括肝、脾、腎、肺、心臟和骨髓）的離體成像證明 CCL2 偶聯的外泌體在肺中的積累顯著增加，這通過肺組織切片的熒光顯微鏡證實。CCL2 優(yōu)先與其受體 CCR2 結合，肺白細胞通常為 CCR2 +。相反，據報道也作為 CCL2 受體發(fā)揮作用的 CCR4，在肺白細胞中無法檢測到。與未結合的外泌體相比，CCL2 結合的外泌體被肺 CD45.2 + CCR2 +白細胞更有效地吸收，而 CD45.2 + CCR2 -白細胞沒有表現出不同的吸收。特別是在顯示不同 CCR2 +和 CCR2 -群體的mMDSC 中，我們發(fā)現與 CCR2 -細胞相比，CCL2 +細胞中CCL2 偶聯的外泌體更豐富，而未偶聯的外泌體攝取相似。還觀察到CCR2 + NK 細胞特異性攝取 CCL2 綴合的外泌體增加的趨勢，盡管沒有統(tǒng)計學意義。與 WT 小鼠中改變的生物和細胞譜系分布相反, CCL2 結合的 BC 外泌體對器官分布沒有影響，肺積聚或肺 CD45.2 +細胞攝取在 CCR2 -/-小鼠中。最后，與未結合的外泌體相比，用 CCL2 結合的外泌體調理 WT 小鼠，然后注射同系癌細胞，導致?肺轉移形成顯著增加（p < 0.05），而對 BC 轉移沒有影響。 CCR2 -/-小鼠的肺。有趣的是，與僅注射 PBS 的對照組相比，單獨重復注射重組 CCL2 不影響 BC 轉移。更有趣的是，先前與 TIF 孵育的外泌體不影響 CCR2 -/-小鼠肺中 BC 細胞的轉移性生長，表明外泌體結合的 CCL2 在 BC 轉移性傳播中的關鍵作用。

   總之，這些數據表明 CCL2 與 BC 外泌體的結合改變了它們的全身生物分布以及細胞譜系特異性的囊泡攝取，并且可能有助于由 TIF 偶聯的 BC 外泌體在遠端器官中誘導的促轉移變化，從而促進BC轉移。