間充質干細胞來源的外泌體microRNA-139-5p通過靶向PRC1抑制膀胱癌的發(fā)生

膀胱癌是世界上第九大流行癌癥，占癌癥相關死亡的相當大比例。目前多數(shù)研究熱點在microRNAs (miRNAs)可以通過間充質干細胞(MSCs)來源的外泌體傳遞到腫瘤細胞中發(fā)揮其功能?，F(xiàn)在有最新研究探討了miR-139-5p向膀胱癌細胞的外泌體轉移及其在腫瘤發(fā)生調控中的作用，支持了MSCs-衍生的外泌體分泌的miR-139-5p在膀胱癌中的腫瘤抑制作用，突出了一個有前景的治療策略。該研究發(fā)表于《Oncogene》，IF：9.867。

技術路線：

主要研究結果：

1. PRC1在膀胱癌中的表達模式及意義

作者對5個膀胱癌數(shù)據(jù)集（GSE7476、GSE52519、GSE65635、GSE40355和GSE3167）進行差異表達分析，通過生信分析發(fā)現(xiàn)PRC1是一個高表達基因，與其他基因廣泛相關（圖1a-c）。此外，GSE7476、GSE65635、GSE40355和GSE3167數(shù)據(jù)集中顯示了PRC1在膀胱癌中高表達(圖1d-g)。接下來，通過逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)、免疫組織化學和western blot分析，確定膀胱癌及癌旁正常組織中PRC1 mRNA和蛋白的表達模式。結果顯示，與對照組相比，膀胱癌組織中PRC1 mRNA和蛋白表達顯著增加，PRC1陽性表達率顯著升高 (圖1h-j)。采用卡方檢驗分析PRC1表達與臨床資料的相關性，發(fā)現(xiàn)PRC1表達與腫瘤淋巴結轉移分期、組織學分級呈正相關，而與年齡、性別、淋巴結轉移或腫瘤數(shù)量(表1)。此外，與正常膀胱上皮細胞HCV29相比，膀胱癌細胞株(T24、J82、UMUC3、5637)中PRC1 mRNA和蛋白表達量較高，其中T24細胞表達量最高(圖1k， l)。因此，選擇T24細胞進行進一步實驗。

圖1 PRC1在膀胱癌中表達異常

2. PRC1功能缺失可改善體外膀胱癌細胞的致瘤特性

通過sh-PRC1評估PRC1在膀胱癌進展中的生物學意義(圖2a)。Edu(圖2b)，末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP-生物素nick末端標記(TUNEL)(圖2c)和Transwell(圖2d-f)檢測表明，細胞增殖、遷移和侵襲能力均減弱，而轉染sh1-PRC1后細胞凋亡率增加。Western blot檢測凋亡相關因子、b細胞白血病/淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、上皮-間質轉化(EMT)相關因子(N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、SNAIL)、增殖相關因子、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達模式。如預期，沉默PRC1后，N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA的表達減少，echerin和Bax的表達增加(圖2g)。綜上所述，這些結果表明PRC1的沉默抑制了膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲潛能，同時促進了膀胱癌細胞的凋亡。

圖2 沉默PRC1抑制膀胱癌細胞增殖潛能，促進膀胱癌細胞凋亡

3. miR-139-5p結合到PRC1的3’UTR

在發(fā)現(xiàn)PRC1在膀胱癌中的作用后，繼續(xù)檢索了mirDIP、miRmap、starBase、TargetScan和microRNA.org等5個數(shù)據(jù)庫，預測調控PRC1的miRNAs，進一步研究膀胱癌進展的分子機制。如圖3a所示，hsa-miR-224-5p和hsa-miR-139-5p這兩個相互重疊的miRNA被確定為潛在靶點。同時，通過分析GSE40355數(shù)據(jù)集篩選膀胱癌中差異表達的miRNA。miR-139-5p在膀胱癌中低表達(圖3b)；PRC1-3’UTR中發(fā)現(xiàn)了潛在的miR-139-5p特異性結合位點(圖3c)；隨后，進雙熒光素酶報告基因實驗、RT-qPCR和Pearson相關性分析，均證明了miR-139-5p能結合PRC1-3’UTR上的位點，它們表達呈負相關 (圖3d-f)。另外，與癌旁組織相比，miR-139-5p在膀胱癌組織中表達較低，在膀胱癌細胞株T24，J82， UMUC3和5637持續(xù)降最低在T24細胞(圖3 g)。同時后續(xù)實驗證明，miR-139-5p是PRC1的負調控因子(圖3h， i)。

圖3 miR-139-5p靶向并負調控PRC1

4. miR-139-5p的上調可通過靶向PRC1改善膀胱癌細胞的致瘤特性

為了研究miR-139-5p在膀胱癌發(fā)展中的功能意義及其靶向PRC1的潛在功能，在T24細胞中過表達或抑制miR-139-5p的表達。通過EdU(圖4a)、TUNEL(圖4b)、Transwell(圖4c， d)和western blot(圖4e)檢測得到的數(shù)據(jù)表明，過表達miR-139-5p可顯著降低T24細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提高細胞凋亡率。同時N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2、PCNA蛋白表達減少，E-cadherin、Bax蛋白表達增加。

圖4 miR-139-5p對膀胱癌進展的抑制作用是通過負向調控PRC1實現(xiàn)的

5. 分離人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)中的外泌體

在光學顯微鏡下觀察到hUCMSCs呈細長或紡錘形，菌落生長，呈旋渦狀排列。同時，hUCMSCs表現(xiàn)出強大的成骨、成脂和成軟骨分化能力(圖5a)，表明hUCMSCs已成功從人臍帶中分離。外泌體隨后從成功分離的hUCMSCs中提取。透射電鏡下觀察到一組圓形或橢圓形、形態(tài)均勻的膜性囊泡，囊泡直徑為52.5-185.5 nm，囊泡周圍可見膜性結構，囊泡中央呈低電子密度(圖5b，c)。Western blot檢測表明，hUCMSCs的外泌體中表面標記物熱休克蛋白70 (HSP70)、CD63和CD9的表達高于hUCMSCs，而葡萄糖調節(jié)蛋白94 (GRP94)的表達低于hUCMSCs (p <0.05;圖5d)，進一步說明外泌體已成功提取。

圖5 hUCMSCs來源的外泌體鑒定

6. hUCMSCs來源的外泌體miR-139-5p在體外改善膀胱癌細胞的致瘤特性

為了驗證T24細胞是否能夠攝取hUCMSCs分泌的外泌體，將CFSE標記的hUCMSCs來源的外泌體與T24細胞共培養(yǎng)48 h，隨后在共聚焦顯微鏡下觀察T24細胞攝取外泌體(圖6a)，結果顯示，hUCMSCs來源的外泌體能夠將miR-139-5p傳遞到T24細胞(圖6b-d)。為了確定外泌體傳遞miR-139-5p的影響，將T24細胞與過表達miR-139-5p的hUCMSCs衍生的外泌體共培養(yǎng)。EdU(圖6e)， TUNEL(圖6f)Transwell(圖6g，h)結果表明，細胞增殖，遷移和入侵的能力都被抑制， 而與外泌體的缺失相比， Exo-NCmimic、Exo-miR-139-5p-mimic和Exo-NC-inhibitor轉染后可促進細胞凋亡。與miR-139-5p mimic轉染的hUCMSCs衍生的外泌體共培養(yǎng)的T24細胞中，N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA蛋白表達減少，E-cadherin和Bax蛋白表達增加(圖6i)。綜上所述，miR-139-5p的傳遞抑制了T24細胞的增殖、侵襲和遷移能力，同時通過hUCMSCs衍生的外泌體加速T24細胞的凋亡。

圖6 hUCMSCs來源的外泌體miR-139-5p抑制膀胱癌細胞增殖潛能并誘導細胞凋亡

7. hUCMSCs來源的外泌體miR-139-5p抑制體內膀胱腫瘤的發(fā)生

最后，為了證明miR- 139-5p在hUCMSCs來源的外泌體體內的抑瘤作用，將裸鼠皮下注射T24細胞，建立皮下移植瘤模型，且驗證了miR-139-5p成功遞送至腫瘤組織(圖7a)。如圖7b-d所示，hUCMSCs來源的外泌體降低了移植瘤的體積和重量，在注射過表達miR-139-5p的hUCMSCs來源的外泌體的裸鼠中，腫瘤體積和重量的降低更為明顯。采集裸鼠腫瘤組織，評估腫瘤組織中PRC1的表達模式，從hUCMSCs中提取的外泌體可以降低PRC1在腫瘤組織中的表達，而從hUCMSCs中提取的外泌體可以顯著降低miR-139-5p在腫瘤組織中的表達(圖7e)。同時，通過western blot檢測腫瘤組織中凋亡、EMT和增殖相關因子的表達模式。結果顯示，Exo-NC-agomir或ExomiR- 139-5p agomir的存在導致N-cadherin、Vimentin、SNAIL、Bcl-2和PCNA的表達降低，而E-cadherin和Bax的表達升高，然而，在對Exo-miR-139-5p agomir的反應中觀察到更為顯著的結果(圖7f)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，從hUCMSCs來源的外泌體中miR- 139-5p成功轉移到T24細胞中，抑制其在裸鼠中的異種移植生長。

圖7 從hUCMSCs來源的外泌體遞送miR-139-5p抑制裸鼠膀胱癌細胞的致瘤性

總結：

該研究為miR-139-5p的抗腫瘤作用提供了新的思路，并進一步為基于外泌體的miR-139-5p傳遞系統(tǒng)在腫瘤細胞中的治療策略提供了案例。結果表明，外泌體遞送miR-139-5p有助于抑制腫瘤發(fā)生(圖8)，為潛在的抑制腫瘤發(fā)生的創(chuàng)新方案奠定了基礎。

圖8 miR-139-5p在膀胱癌中的作用及其分子機制示意圖

參考文獻：

Jia Y, Ding X, Zhou L, Zhang L, Yang X. Mesenchymal stem cells-derived exosomal microRNA-139-5p restrains tumorigenesis in bladder cancer by targeting PRC1. Oncogene. 2021, 40(2):246-261. doi: 10.1038/s41388-020-01486-7. Epub 2020 Oct 29. PMID: 33122828.