circINPP4B調(diào)節(jié)自身免疫性腦脊髓炎的Th17細(xì)胞分化

CircRNAs調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)和病理過程。然而，關(guān)于特定circRNA對T輔助細(xì)胞17 (Th17)分化和相關(guān)自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化癥(MS)的影響知之甚少。本文使用轉(zhuǎn)錄組微陣列分析實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的不同階段，確定了與EAE進(jìn)展相關(guān)的circINPP4B，該circINPP4B在EAE小鼠Th17細(xì)胞和Th17體外分化過程中表達(dá)上調(diào)。該文于2021年8月發(fā)表于《Cellular Molecular Immunology》IF:11.53雜志上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、通過芯片分析鑒定與EAE相關(guān)的circRNA

作者構(gòu)建了EAE小鼠模型，通過EAE的臨床特征得分分為4組，如圖1A所示，EAE的染色表現(xiàn)為脊髓炎癥浸潤和脫髓鞘加重。取不同鑒定分?jǐn)?shù)(0、1、2、3、4)的EAE小鼠外周血CD4+淋巴細(xì)胞進(jìn)行芯片檢測，獲得差異表達(dá)的circRNA，其中circRNA-3998在EAE得分高的組中高表達(dá)，提示可能與EAE進(jìn)展有關(guān)。

圖1 通過微陣列分析鑒定EAE相關(guān)的circRNA

2、在CD4+T細(xì)胞中circINPP4B的特征

如圖2所示，circRNA-3998定位于8號染色體，包含6個(gè)外顯子，來源于INPP4B基因，長684bp，其反向剪切位點(diǎn)位于外顯子8和外顯子3之間，并通過隨機(jī)引物和oligo (dT)18引物證實(shí)其環(huán)狀特性。將其命名為circINPP4B。

圖2 在CD4+T細(xì)胞中circINPP4B的特征

3、CircINPP4B與Th17細(xì)胞體外分化有關(guān)

為了探究circINPP4B的表達(dá)水平和在EAE進(jìn)展中的特異性，作者檢測了來源于0-4分EAE小鼠的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示隨著EAE的加重，circINPP4B在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)逐漸升高（圖3A）。并且與在CD4+ Tn細(xì)胞中相比，circINPP4B在CD4⁺ IL-17⁺ T細(xì)胞中表達(dá)升高明顯，在CD4+IFN-γ+ T細(xì)胞和CD4⁺CXCR5⁺ T細(xì)胞中表達(dá)稍微增長（圖3B）。于是進(jìn)一步探究circINPP4B在CD4⁺ IL-17⁺ T細(xì)胞中的作用。作者在體外誘導(dǎo)CD4+ Tn細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)circINPP4B的表達(dá)隨著誘導(dǎo)天數(shù)逐漸增加（圖3C）。FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明circINPP4B在Rorγt⁺Th17細(xì)胞中顯著高表達(dá)（圖3D）。之后作者發(fā)現(xiàn)，敲除circINPP4B后，導(dǎo)致分化為Th17細(xì)胞的比例顯著下降同時(shí)也降低了Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌水平（圖3E-I）。以上結(jié)果表明circINPP4B與Th17細(xì)胞體外分化有關(guān)。

圖3 CircINPP4B與Th17細(xì)胞體外分化有關(guān)

 
4、沉默circINPP4B可緩解體內(nèi)EAE

基于以上circINPP4B高表達(dá)與EAE進(jìn)展有關(guān)的事實(shí)，構(gòu)建CD4+淋巴細(xì)胞circINPP4B敲除的小鼠模型。MOG_35-55免疫后，circINPP4B沉默小鼠出現(xiàn)EAE緩解，發(fā)病延遲，EAE峰值評分降低（圖4A-B）。HE和LFB染色表明circINPP4B沉默小鼠的脊髓切片的炎癥浸潤和脫髓鞘更低，此外其MBP蛋白水平增加，并具有更多有髓鞘的軸突和更厚的髓鞘（圖4C）。此外，與對照鼠相比，circINPP4B沉默小鼠的外周血，脊髓和淋巴結(jié)中IL-17+淋巴細(xì)胞組分更低，Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平更少（圖4D-F）。

為了進(jìn)一步證實(shí)circINPP4B在體內(nèi)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的作用，將circINPP4B沉默的CD4+ Tn細(xì)胞轉(zhuǎn)至年齡匹配的Rag1^?/?免疫缺陷小鼠中，然后進(jìn)行EAE誘導(dǎo)。盡管實(shí)驗(yàn)小鼠和對照小鼠的CD4+細(xì)胞數(shù)量無差別，但是接受circINPP4B沉默的CD4+ Tn細(xì)胞轉(zhuǎn)移的Rag1^?/?小鼠的EAE得分更低，且IL-17+淋巴細(xì)胞組分更低，而IFN-γ+淋巴細(xì)胞沒有差異。這些表明沉默circINPP4B可能抑制Th17細(xì)胞分化，進(jìn)而緩解EAE。

圖4 沉默circINPP4B可緩解體內(nèi)EAE

5、CircINPP4B作為miR-30a的海綿

為了鑒定與circINPP4B相互作用的miRNA，對不同得分EAE小鼠來源的外周血CD4+淋巴細(xì)胞進(jìn)行miRNA微陣列分析，獲得差異表達(dá)的miRNA，根據(jù)circINPP4B的表達(dá)趨勢，作者關(guān)注于在EAE得分增加的小鼠中下調(diào)表達(dá)的9個(gè)miRNA，并構(gòu)建了網(wǎng)絡(luò)圖哦，其中circINPP4B與miR-30a的相互作用強(qiáng)烈（圖5A-C）。此外，在Th17細(xì)胞分化過程中，circINPP4B的表達(dá)逐漸增加，而miR-30a的表達(dá)逐漸下降，且敲除circINPP4B后miR-30a的表達(dá)顯著增加，FISH結(jié)果顯示circINPP4B和miR-30a具有明顯的共定位，RIP的結(jié)果表明circINPP4B和miR-30a都在AGO2抗體中顯著富集，且circINPP4B探針可以顯著下拉miR-30a序列；最后，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-30a可以顯著下調(diào)野生型circINPP4B的熒光素酶活性，但對circINPP4B突變體沒有影響?？傊?，以上結(jié)果表明circINPP4B可海綿吸附miR-30a。

圖5 CircINPP4B作為miR-30a的海綿

6、CircINPP4B通過miR-30a調(diào)控Th17細(xì)胞分化

作者之前的研究表明miR-30a可在體內(nèi)外抑制Th17細(xì)胞分化通過靶向IL-21R。因此，這里作者評估了circINPP4B/miR-30a軸對Th17細(xì)胞分化的影響。挽救實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在Th17誘導(dǎo)過程中，miR-30a抑制Th17形成，但是circINPP4B通過增加IL-17+的比例和Th17相關(guān)細(xì)胞因子的分泌以及Rorγt和IL-21R促進(jìn)Th17的分化（圖6A-D）。此外，circINPP4可以部分反轉(zhuǎn)miR-30a的抑制作用，即與過表達(dá)miR-30a組比較，共過表達(dá)circINPP4B和miR-30a組顯著增加了Th17細(xì)胞分化。鑒于圖3I顯示沉默circINPP4B后IL-21的水平顯著下降，因此為了確定IL-21下調(diào)是否是導(dǎo)致Th17細(xì)胞分化抑制的原因之一，作者在培養(yǎng)基中加入了外源性IL-21，結(jié)果顯示當(dāng)circINPP4B敲除時(shí)外源IL-21不能增加Th17的比例，因此，與IL-21無關(guān)?？傊?，以上結(jié)果表明circINPP4B通過阻礙miR-30a對IL-21R的抑制作用促進(jìn)Th17分化。

圖6 CircINPP4B通過miR-30a調(diào)控Th17細(xì)胞分化

綜上所述，如圖7，本研究使用轉(zhuǎn)錄組芯片篩選了EAE不同階段小鼠中差異表達(dá)的circRNAs，并鑒定出circINPP4B，它可以通過海綿吸附miR-30a調(diào)控Th17的分化和EAE的發(fā)展。

圖7 circINPP4B/miR-30a/IL-21R軸在EAE進(jìn)展中調(diào)控Th17細(xì)胞分化的原理模型。miR-30a是Th17分化中的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)被circINPP4B吸收。紅星表示作者之前的結(jié)果。紅色問號代表了本研究的研究重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Han Jingjing., Zhuang Wei., Feng Wanhua., Dong Fuxing., Hua Fang., Yao Ruiqin., Qu Xuebin.(2021). The circular RNA circINPP4B acts as a sponge of miR-30a to regulate Th17 cell differentiation during progression of experimental autoimmune encephalomyelitis. Cell Mol Immunol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41423-021-00748-y