circPDE3B促進食管癌進展

越來越多的證據(jù)表明，circRNAs作為功能性RNA在各種癌癥中發(fā)揮著關鍵作用。然而，大多數(shù)circRNA參與食管鱗狀細胞癌(ESCC)的機制仍未明確，其介導的分子機制也大多不清楚。小編給大家分享2021年7月發(fā)表于“CELL DEATH & DISEASE”（IF=8.469）的文章“Circular RNA hsa_circ_0000277 sequesters miR-4766-5p to upregulate LAMA1 and promote esophageal carcinoma progression”。在這里，我們篩選了circRNA在ESCC組織中的表達譜，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，hsa_circ_0000277(稱為circPDE3B)在ESCC組織和細胞系中的表達顯著增加。circPDE3B在ESCC患者中的高表達與晚期TNM分期和預后不佳相關。功能實驗表明，circPDE3B在體外和體內(nèi)均能促進ESCC細胞的發(fā)生和轉移。circPDE3B可以作為ceRNA，通過miR4766-5p來消除對LAMA1的抑制作用。此外，LAMA1在ESCC組織中顯著上調，并與侵襲性致癌表型呈正相關。更重要的是， circPDE3B在ESCC中的致癌作用部分依賴于miR-4766-5p/LAMA1軸。生物信息學分析結合驗證實驗表明，上皮-間充質轉化(EMT)激活參與了circPDE3B-miR-4766-5p /LAMA1軸在ESCC中的致癌功能。

技術路線

結果

1）circPDE3B在ESCC組織和細胞系中表達上調

我們使用circRNA微陣列分析了三對ESCC組織樣本來研究ESCC組織的circRNA表達譜。與匹配的非腫瘤組織相比，ESCC組織中hsa_circ_0000277(也稱為circPDE3B)的表達顯著增加(圖1A，B)。將PDE3B mRNA序列與來自circBase的預期circPDE3B序列進行比較，發(fā)現(xiàn)circPDE3B是環(huán)狀的，包含其親本基因的2-4外顯子(圖1C)。我們使用Sanger測序來確認頭尾拼接(圖1D)。RT-PCR表明circPDE3B只能在cDNA中擴增，而不能在gDNA中擴增(圖1E)。我們使用RNase R來確認circPDE3B的穩(wěn)定性。RNase R顯著降低PDE3B線性形式的水平，但不消化circPDE3B(圖1F)。對放線菌素D的抗性也證實了circPDE3B的環(huán)狀結構(圖1G)。接下來，我們通過qRT-PCR研究circPDE3B在ESCC細胞株中的表達。circPDE3B在ESCC細胞系中表達上調(圖1H)。此外，qRT-PCR檢測到92對ESCC樣本中circPDE3B的表達高于相鄰正常樣本(圖1I)。原位雜交(ISH)也證實circPDE3B表達升高(圖1J)。因此，我們隨后的實驗聚焦于circPDE3B在ESCC進展中的作用。

2）circPDE3B表達上調與ESCC臨床預后不良相關

為了研究circPDE3B表達與ESCC臨床病理特征的相關性，我們將92例ESCC患者分為低circPDE3B表達組和高circPDE3B表達組。采用卡方檢驗評估兩組間的臨床病理因素。圖2A-C顯示較高的circPDE3B表達與淋巴轉移、晚期 TNM分期和較差的組織學分級呈正相關。無病生存率(DFS)的單因素Cox比例風險分析顯示，circPDE3B表達是一個重要的預后因素(圖2D)。此外，Kaplan-Meier分析顯示，與circPDE3B低表達的患者相比，circPDE3B高表達的ESCC患者表現(xiàn)出較差的OS和DFS率(圖2E, F)。這些結果表明，circPDE3B上調參與了ESCC的進展，可能是一個潛在的預后靶點。

3）circPDE3B促進體外ESCC細胞生長和侵襲

我們使用功能缺失和功能獲得策略來研究circPDE3B在ESCC細胞中的生物學功能。CCK-8結果表明circPDE3B敲低顯著抑制了TE-1和EC9706細胞的增殖能力(圖3A)。菌落形成實驗表明，circPDE3B對保持高的菌落形成能力有重要影響(圖3B)。同樣，EdU實驗表明，circPDE3B敲低抑制了ESCC細胞的DNA合成率(圖3C)。Transwell分析顯示，與sh-NC(陰性對照)組相比，sh-circPDE3B組遷移和侵襲的細胞明顯更少(圖3D)。此外，circPDE3B過表達與細胞生長能力顯著增加相關(圖3E-G)，并大大增強TE-10和KYSE-410細胞的遷移和侵襲潛能(圖3H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circPDE3B在體外可促進細胞增殖，顯著增強ESCC細胞的侵襲和遷移。

4）circPDE3B在內(nèi)促進ESCC細胞生長和侵襲

我們通過在裸鼠右側皮下注射circPDE3B基因敲除的EC9706細胞建立異種移植瘤模型，并注射小鼠側尾靜脈建立肺轉移模型，驗證沉默circPDE3B對腫瘤生長和轉移的抑制作用。我們使用活體成像系統(tǒng)每3天動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長情況。circPDE3B敲低導致皮下腫瘤中的熒光信號顯著降低(圖4A)。腫瘤在接種circPDE3B敲低EC9706細胞的小鼠中發(fā)展更慢(圖4 B，C)。qRT-PCR檢測到在circPDE3B沉默的異種移植瘤中較低的circPDE3B表達(圖4D)。此外，與陰性對照相比，circPDE3B沉默的異種移植瘤具有更少的Ki-67陽性核(圖4E)。與NC細胞相比，接種circPDE3B沉默的EC9706細胞的小鼠的肺微轉移灶更少、更小(圖4F)。綜上所述，circPDE3B敲低可以抑制ESCC細胞的生長和體內(nèi)轉移潛能。

5）circPDE3B通過海綿化miR-4766-p發(fā)揮其功能

FISH顯示circPDE3B主要定位于細胞質。因此，我們進一步探討了circPDE3B是否在ESCC細胞中海綿miRNAs。我們通過starBase和circBank將circPDE3B序列miRNA識別元件的預測結果重疊，選擇兩個候選miRNA(圖5A)。然后，我們檢測候選miRNAs是否可以直接結合circPDE3B。qRT-PCR顯示，在ESCC細胞中，miR-4766-5p而非miR-2114-3p顯著下調了circPDE3B的表達(圖5B, C)。circPDE3B過表達降低了miR-4766-5p的表達，而circPDE3B敲低則增強了miR-4766-5p的表達(圖5D)。我們還預測了miR-4766-5p和circPDE3B結合位點(圖5E)，并使用雙熒光素酶報告基因檢測circPDE3B熒光素酶強度。miR-4766-5p顯著抑制了野生型circPDE3B的熒光素酶強度，但突變型circPDE3B未受影響(圖5F)。此外，AGO2免疫沉淀分析表明，與NC組相比，miR-4766-5p捕獲的部分具有circPDE3B的>5倍富集(圖5G)。與正常組織相比，ESCC組織中miR-4766-5p的表達顯著降低(圖5H)。ESCC組織中miR-4766-5p與circPDE3B表達水平呈負相關(圖5I)。在驗證了circPDE3B與miR-47665p之間的相互作用后，我們檢測了circPDE3B的致癌功能是否歸因于其對miR-4766-5p的抑制作用。miR-4766-5p過表達顯著抑制了轉染的TE-1和EC9706細胞的增殖能力，而與circPDE3B載體共轉染部分逆轉了抑制作用(圖5J，K)。circPDE3B上調逆轉了異位miR-4766-5p表達導致的遷移和侵襲性細胞數(shù)量的減少(圖5L，M)。這些結果表明，circPDE3B至少部分通過調節(jié)miR-4766-5p來促進ESCC細胞的侵襲性致癌表型。

6）circPDE3B通過miR-4766-5p調控LAMA1

我們使用了TargetScan和starBase來識別miR-4766-5p的假定靶基因，同時根據(jù)TCGA)析篩選出ESCC組織中上調的候選mRNA。我們選擇10種候選mRNA (ALX1, CENPK, DNMT3B, ELOVL2, FNDC1, GINS1, HELLS, LAMA1, ONECUT2, RTKN2)進行qRT-PCR驗證(圖6A)。miR-4766-5p調節(jié) LAMA1、ELOVL2和ONECUT2的mRNA水平(圖6B)，但與NC相比，僅LAMA1的蛋白水平有顯著變化(圖6C)。我們進行了雙熒光素酶報告基因實驗，以確認LAMA1和miR4766-5p是否直接相互作用。轉染的miR-4766-5p和野生型LAMA1的熒光素酶報告基因活性顯著降低，而突變型LAMA1的熒光素酶報告基因活性沒有明顯改變(圖6D)。此外，通過相關性分析，miR-4766-5p與LAMA1在ESCC組織中呈負相關，提示可能存在結合能力(圖6E)?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們假設circPDE3B通過海綿miR-4766-5p調控LAMA1的表達。qRT-PCR和western blotting結果顯示，在ESCC細胞中，circPDE3B敲低顯著降低了LAMA1的表達，而circPDE3B強制表達顯著增強了LAMA1的表達(圖6F，G)。拯救實驗顯示，miR-4766-5p模擬物部分逆轉了circPDE3B過表達對LAMA1表達的啟動子效應(圖6H)。此外，circPDE3B和LAMA1在ESCC組織中表達的相關性研究顯示二者顯著正相關(圖6I)。同時，LAMA1較強的免疫組化染色強度與ESCC組織中circPDE3B表達升高呈正相關(圖6J)?？傊覀兊陌l(fā)現(xiàn)證實了我們的假設，circPDE3B海綿miR-4766-5p，隨后增加LAMA1的表達。

7）circPDE3B的致癌作用部分依賴于LAMA1

為了研究LAMA1在ESCC侵襲表型中的作用，我們進行了qRT-PCR，結果表明LAMA1在ESCC細胞系(圖7A)和組織(圖7B)中過表達。TCGA ESCC數(shù)據(jù)集也得到了類似的結果(圖7C)。同樣，對10對匹配的ESCC組織和相鄰的非癌組織進行western blotting，發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中LAMA1表達顯著上調(圖7D)。通過免疫組化研究LAMA1在組織中的表達，發(fā)現(xiàn)ESCC組織比相鄰的非癌組織具有更強的LAMA1染色(圖7E)。與LAMA1低表達的患者相比，LAMA1高表達的患者平均OS和DFS天數(shù)減少(圖7F)。這些結果均提示LAMA1可能在ESCC進展中發(fā)揮致癌作用。接著，我們驗證了circPDE3B在ESCC中的致癌活性是否依賴于LAMA1。CCK-8和集落形成實驗表明，抑制LAMA1表達可損害細胞增殖。然而，共轉染circPDE3B載體顯著逆轉了這種抑制作用(圖7G，H)。同樣，與circPDE3B載體共轉染后，LAMA1沉默誘導的受損細胞遷移和侵襲能力被消除(圖7I，J)。為了探討circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸對體內(nèi)ESCC生長和轉移的影響，我們建立了以下四個EC9706細胞組：NC (sh-NC)、穩(wěn)定的LAMA1敲低(sh-LAMA1)、穩(wěn)定的circPDE3B過表達(circPDE3B和sh-NC)、穩(wěn)定的circPDE3B過表達伴有LAMA1抑制(circPDE3B和sh-LAMA1)。體內(nèi)腫瘤形成實驗表明，與NC相比，LAMA1敲低顯著抑制了腫瘤的生長，而circPDE3B過表達極大地促進了腫瘤的生長(圖7K)。此外，LAMA1的抑制部分消除了circPDE3B過表達對腫瘤生長的促進作用。LAMA1沉默主要降低Ki-67的表達，circPDE3B重引入可逆轉這一現(xiàn)象(圖7L)。有趣的是，LAMA1的下調大大降低了轉移瘤的數(shù)量和大小，而強化的circPDE3B表達再次抵消了這一變化(圖7M)?？偟膩碚f， circPDE3B的致癌作用部分依賴于LAMA1。

8）circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸通過激活EMT促進ESCC進展

我們研究了circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸參與ESCC進展的基本機制。KEGG分析(圖8A)、GSVA(圖8B)、GSEA(圖8C)表明LAMA1高表達與EMT激活密切正相關，提示EMT可能是LAMA1在ESCC中致癌作用的原因。正如預期的那樣，western blotting顯示，LAMA1敲低后，MMP2/7/9、N-cadherin、Snail、Slug和vimentin的蛋白水平降低，E-cadherin的蛋白水平升高(圖8D，E)。此外，circPDE3B沉默后也觀察到類似的抑制作用(圖8F)。拯救實驗發(fā)現(xiàn)，miR-4766-5p inhibitor共轉染顯著逆轉了circPDE3B沉默誘導的EMT抑制作用(圖8F)， 然而LAMA1 siRNA共轉染顯著逆轉了circPDE3B過表達誘導的EMT促進作用?？傊?，circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1軸通過激活EMT促進ESCC進展。

結論：我們的研究結果表明，circPDE3B在食管鱗癌組織中上調，circPDE3B高表達是食管鱗癌患者生存不良的獨立預后因素。CircPDE3B通過miR-4766-5p來促進LAMA1的表達，從而促進ESCC細胞的腫瘤發(fā)生和轉移。circPDE3B-miR-4766-5p LAMA1軸通過激活EMT調控ESCC進展。circPDE3B miR-4766-5p LAMA1軸因此可能作為食管鱗癌預后的生物標志物和治療靶點。