新連接——GOT1抑制通過(guò)ferroptosis促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞死亡

癌癥代謝被重新連接，以支持細(xì)胞生存，以應(yīng)對(duì)內(nèi)在和環(huán)境的壓力。鑒定靶向這些適應(yīng)機(jī)制的策略是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。作者此前發(fā)現(xiàn)GOT1驅(qū)動(dòng)通路在胰腺癌中維持氧化還原平衡。在這里，作者試圖鑒定GOT1抑制后的大寫(xiě)依賴(lài)以表征胰腺癌的特征并為氧化還原代謝提供新的見(jiàn)解。本文于2021年8月發(fā)表在《Nature Communications》IF：14.919期刊上。

技術(shù)路線(xiàn)

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、PDA細(xì)胞利用GOT1促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)

作者此前的工作證明，胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）細(xì)胞重新連接蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭線(xiàn)以生成NADPH（Fig. 1a）。為了確定GOT1在PDA中使用時(shí)間控制，作者使用dox敲除分別GOT1的編碼區(qū)和3’UTR（sh1和sh3），以及對(duì)照shNT。結(jié)果顯示sh1和sh3顯著敲除GOT1的表達(dá)并細(xì)胞集落形成（Fig. 1b, c）。在18個(gè)細(xì)胞系中，有12個(gè)細(xì)胞系的GOT1敲除顯著損害了菌落形成（Fig. 1d）。但是對(duì)GOT1敲除的響應(yīng)不依賴(lài)于蘋(píng)果樹(shù)-天冬氨酸穿梭酶的表達(dá)狀態(tài)。然后檢測(cè)GOT1對(duì)已建立的小鼠PDA腫瘤的抑制作用。結(jié)果顯示，dox誘導(dǎo)GOT1敲除后，GOT1敏感細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制（Fig. 1e, f）。這些結(jié)果表明PDA利用GOT1促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。

圖1 對(duì)于細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)GOT1是PDA必須的

2、限制外源性胱氨酸可增強(qiáng)GOT1抑制

由于與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，GOT1抑制在PDA中具有獨(dú)特的細(xì)胞抑制作用，因此作者試圖識(shí)別由GOT1敲低誘導(dǎo)的代謝缺陷，從而靶向殺死PDA。為了該目的，作者檢測(cè)了GOT1敲低PDA細(xì)胞對(duì)代謝靶向小分子反應(yīng)的敏感性。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5天的dox處理以確保GOT1敲除，然后再進(jìn)行3天的藥物處理（Fig. 2a）。與一些抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，GOT1抑制是有保護(hù)作用的，表現(xiàn)為曲線(xiàn)值下的面積增加，這是一種藥物敏感性的測(cè)量（Fig. 2b）。5種最常用的脫敏劑中有3種是化療藥物，這與之前的觀(guān)察結(jié)果一致。相比之下，GOT1敲除增強(qiáng)了erastin的敏感性（Fig. 2b, c）。Erastin是胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的抑制劑，它將胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中以交換谷氨酸。胱氨酸，半胱氨酸的氧化二聚體，在進(jìn)入細(xì)胞后被還原為半胱氨酸，在細(xì)胞內(nèi)它可以促進(jìn)谷胱甘肽和蛋白質(zhì)的合成，以及許多其他生化命運(yùn)。GOT1敲除增強(qiáng)了PDA細(xì)胞系的erastin敏感性（Fig. 2d）并且與dox是否干擾無(wú)關(guān)。這種GOT1增強(qiáng)效應(yīng)被erastin類(lèi)似物咪唑酮erastin (IKE) 復(fù)制，而和IKE聯(lián)合處理可導(dǎo)致部分細(xì)胞毒性（Fig. 2e）。與單一處理組相比，erastin或IKE處理GOT1敲除細(xì)胞減少了細(xì)胞數(shù)量，但這可以通過(guò)補(bǔ)充外源性半胱氨酸、谷胱甘肽來(lái)源GSH-EE或NAC而反轉(zhuǎn)（Fig. 2f）。這與胱氨酸導(dǎo)入到系統(tǒng)xc維持谷胱甘肽水平至關(guān)重要的結(jié)果一致。在PDA腫瘤中胱氨酸水平是有限的。在腫瘤相關(guān)中培養(yǎng)細(xì)胞以胱氨酸時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)了GOT1的下調(diào)（Fig. 2g）。胱氨酸對(duì)GOT1敲除小鼠PDA生長(zhǎng)的影響與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致?？傊?，在GOT1抑制后，PDA培養(yǎng)物對(duì)外源性胱氨酸戒斷敏感。

圖2 GOT1抑制之后細(xì)胞活力和生長(zhǎng)PDA離不開(kāi)胱氨酸

3、抑制谷胱甘肽的生物合成可增強(qiáng)GOT1基因下調(diào)的生長(zhǎng)抑制作用

谷胱甘肽（GSH）可以由半胱氨酸重新合成，也可以由氧化的谷胱甘肽(GSSG)經(jīng)NADPH還原再生（Fig. 3a）。GOT1抑制導(dǎo)致GSSG和NADP+增加，而GSH和NADPH隨細(xì)胞系而異。因此，作者推測(cè)抑制谷胱甘肽的生物合成可能增強(qiáng)GOT1敲除。GSH合成的限速步驟可以被BSO抑制。在24小時(shí)的藥物處理后，GOT1的抑制有效地增強(qiáng)了對(duì)BSO的敏感性，與單藥反應(yīng)溫和效應(yīng)相比，并且BSO暴露72 h會(huì)放大這增強(qiáng)作用（Fig. 3b, c）。抑制GOT1可增強(qiáng)BSO對(duì)增殖作用（Fig. 3d）。通過(guò)補(bǔ)充外源性GSH-EE或NAC可恢復(fù)上述對(duì)細(xì)胞活力的組合效應(yīng)（Fig. 3e），表明氧化還原失衡。GOT1敲除和BSO暴露對(duì)細(xì)胞的組合作用在小鼠體內(nèi)同樣適用（Fig. 3f, g）。總之，數(shù)據(jù)表明，在GOT1敲除的條件下，PDA需要谷胱甘肽的合成來(lái)維持生存和生長(zhǎng)。

圖3在GOT1抑制下，PDA的生長(zhǎng)需要谷胱甘肽的合成

4、GOT1抑制增強(qiáng)鐵死亡的敏感性

先前的研究表明，某些細(xì)胞類(lèi)型對(duì)erastin和BSO敏感，這些藥物可以通過(guò)消耗GSH來(lái)殺死細(xì)胞。GSH消耗的近端效應(yīng)是通過(guò)GPX4活性的喪失介導(dǎo)的，GPX4利用GSH作為輔助因子來(lái)解毒脂質(zhì)過(guò)氧化物（Fig. 4a）。這可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的致命積累和鐵死亡。雖然GOT1抑制不能誘導(dǎo)鐵死亡，但本文的數(shù)據(jù)表明它可能為PDA細(xì)胞誘導(dǎo)鐵死亡。

為了研究GOT1是否能使PDA對(duì)鐵死亡敏感，首先檢測(cè)GOT1與RSL3的組合效應(yīng)，RSL3是GPX4的共價(jià)抑制劑和鐵死亡的直接誘導(dǎo)劑。RSL3聯(lián)合GOT1敲除比單獨(dú)使用更有效（Fig. 4b）。GOT1增強(qiáng)了一組PDA細(xì)胞系的鐵死亡，這種作用與dox效應(yīng)無(wú)關(guān)（Fig. 4c）。此外，RSL3聯(lián)合GOT1敲除顯著降低細(xì)胞增殖而增強(qiáng)了細(xì)胞毒性（Fig. 4d）。然后使用C11- BODIPY脂質(zhì)過(guò)氧化傳感器來(lái)研究GPX4和GOT1抑制如何影響脂質(zhì)過(guò)氧化。單獨(dú)抑制GOT1可導(dǎo)致適度的脂質(zhì)ROS，但與RSL3或erastin聯(lián)合使用可增強(qiáng)脂質(zhì)ROS的積累；這種增強(qiáng)作用可通過(guò)與親脂抗氧化劑鐵抑制素-1 (Fer-1)共同處理逆轉(zhuǎn)（Fig. 4e）。

隨后，作者檢測(cè)了GOT1對(duì)鐵死亡的作用是否可以通過(guò)與緩解脂質(zhì)過(guò)氧化或螯合鐵的藥物共同處理來(lái)抑制。與Fer-1聯(lián)合處理在可以抑制多個(gè)小分子的GOT1增強(qiáng)效應(yīng)，用親脂抗氧化劑，Trolox，或鐵螯合劑脫鐵胺(DFO)處理，可以為細(xì)胞提供顯著的保護(hù)作用（Fig. 4f）。為了排除凋亡、壞死或自噬細(xì)胞死亡機(jī)制的可能性，用這些細(xì)胞死亡途徑的特征明確的抑制劑共同抑制GOT1，結(jié)果顯示，與Trolox或DFO相比，這些抑制劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用非常有限?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，在細(xì)胞培養(yǎng)中，GOT1抑制啟動(dòng)了PDA的鐵死亡。

圖4 GOT1抑制增強(qiáng)鐵死亡

5、GOT1抑制通過(guò)促進(jìn)不穩(wěn)定鐵誘導(dǎo)PDA鐵死亡

研究表明代謝紊亂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鐵自適應(yīng)釋放，以支持線(xiàn)粒體的能量代謝?？紤]到鐵死亡的易感性與游離鐵的可得性有關(guān)，作者假設(shè)細(xì)胞內(nèi)鐵水平可能會(huì)隨著GOT1抑制介導(dǎo)的能量應(yīng)激而增加。作者通過(guò)測(cè)量Calcein-AM來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)，Calcein-AM是一種熒光素衍生的探針，當(dāng)與亞鐵(Fe2+)結(jié)合時(shí)被淬滅。GOT1正常細(xì)胞的Calcein-AM染色確定基線(xiàn)熒光，GOT1基因敲除后，細(xì)胞熒光分布降低，表明活性鐵池增加（Fig. 5a）。在培養(yǎng)細(xì)胞中使用RhoNox-1鐵探針證實(shí)了這一觀(guān)察（Fig. 5b），在皮下和原位腫瘤中觀(guān)察到總鐵水平升高（Fig. 5c）。不穩(wěn)定鐵的影響在表型上很明顯，在GOT1缺乏的條件下，需要更高濃度的鐵螯合劑DFO來(lái)挽救細(xì)胞活力（Fig. 5d）。最后，補(bǔ)充檸檬酸鐵銨(FAC)可增強(qiáng)鐵死亡（Fig. 5e, f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GOT1敲低可促進(jìn)不穩(wěn)定鐵，鐵會(huì)增強(qiáng)鐵死亡。

GOT1敲低可增強(qiáng)對(duì)FINO2（一種藥理性鐵氧化劑）的敏感性。通過(guò)下調(diào)鐵外流、上調(diào)鐵攝取或促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鐵載體降解，可以改變鐵水平，即鐵蛋白(FTN)或血紅素。為了檢測(cè)這些途徑中哪一條導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵增加，首先檢測(cè)了鐵運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá)。GOT1敲低不改變鐵運(yùn)輸?shù)鞍?/span>SLC40A1的表達(dá)。血紅素加氧酶1 (HMOX1)的表達(dá)在Pa-Tu-8902細(xì)胞中未發(fā)生改變，但在MIA PaCa-2中表達(dá)上調(diào)。GOT1敲低對(duì)NCOA4和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1影響最小。相比之下，IRP2水平較低，FTN水平較高，這兩種水平在高鐵負(fù)荷下均應(yīng)出現(xiàn)。Pa-Tu-8902細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和基因集富集分析都揭示了分解途徑的特征通路“溶酶體”和“自噬-溶酶體”。與此一致，GOT1敲除增加了LC3-A/B II/I比值，降低了P62水平，與自噬通量的增加一致（Fig. 5g）。溶酶體抑制劑羥氯喹和Baf-A1說(shuō)明，GOT1抑制增加自噬通量，而不是延緩自噬過(guò)程。

圖5 GOT1抑制促進(jìn)不穩(wěn)定鐵釋放

總之，如Fig. 5i所示，抑制GOT1可抑制大量PDA細(xì)胞系、原發(fā)腫瘤模型和異種移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)使一些PDA細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡。抑制胱氨酸輸入、GSH合成或GPX4可與GOT1協(xié)同觸發(fā)鐵死亡。這種效應(yīng)可能是由于氧化還原破壞、線(xiàn)粒體抑制和適應(yīng)性不穩(wěn)定鐵釋放的聯(lián)合作用，所有這些都是已知的增強(qiáng)鐵死亡的因素。

參考文獻(xiàn)：

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