ipla2 β介導的脂質(zhì)解毒控制p53驅(qū)動的不依賴GPX4的鐵死亡

         p53腫瘤抑制因子的失活是大多數(shù)癌癥形成的關(guān)鍵事件。P53作為一個轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)各種類型的細胞過程來抑制癌癥的發(fā)展，發(fā)揮著核心作用。雖然p53的經(jīng)典作用包括細胞周期阻滯、凋亡和衰老，這些被認為是腫瘤抑制的主要機制，但最近的研究表明，非傳統(tǒng)的機制也對腫瘤抑制有重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)p53通過其代謝靶點在調(diào)節(jié)癌細胞中ferroptosis反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，該研究2021年6月發(fā)表在《Nature communications》，IF為12.121。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1. p53誘導的ferroptosis與GPX4無關(guān)

為了解決p53介導的ferroptosis是否可以獨立于GPX4功能而誘導，作者生成了人骨肉瘤細胞系U2OS的ACSL4/GPX4雙敲除衍生物。如圖1a所示，ACSL4和GPX4的缺失對p53的水平?jīng)]有影響，p53介導的p21轉(zhuǎn)錄激活或p53介導的SLC7A11抑制仍然完好無損。此外，由于缺乏ACSL4，這些細胞可以抵抗由erastin(圖1b)或GPX4抑制劑RSL 3(圖1c)誘導的ferroptosis。然而，當ACSL4/GPX4缺失細胞暴露于ROS生成器TBH和p53激活因子Nutlin時，很容易觀察到ferroptosis (圖1d)。此外，這些p53介導的反應(yīng)可被已知的ferroptosis抑制劑(如Ferr 1、DFO和Lipro-1)特異性阻斷，而不能被其他細胞死亡途徑的抑制劑阻斷，如凋亡、自噬或壞死(圖1d)。

接下來，作者研究了其他ROS生成化合物，如與TBH化學結(jié)構(gòu)非常相似的DDM?9,2-butanone peroxide (BTP)和氫過氧化物異丙苯(CMH)，是否可以誘導p53介導的ferroptosis (圖2a)。在相同條件下，這兩種化合物都容易在親本和ACSL4/GPX4缺失的U2OS細胞中誘導高水平的ferroptosis (圖2b, c)。此外，用C11-BODIPY染色的流式細胞術(shù)觀察到，當親本或ACSL4/GPX4缺失細胞分別用Nutlin和TBH處理時，內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化水平升高，這是ferroptosis的關(guān)鍵標志(圖2d, e)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明p53驅(qū)動的鐵下垂在高水平ROS下是通過獨立于GPX4的方式誘導的。

圖1 p53介導的ferroptosis不依賴于GPX4誘導的活性氧應(yīng)激

圖2 BTP或CMH具有與TBH相似的效應(yīng)

2. iPLA2β在不同應(yīng)激水平上受到p53的不同調(diào)控

為了確定iPLA2β基因是否確實受p53調(diào)控，作者檢測了在Nutlin或阿霉素(一種常見的DNA損傷試劑)激活p53時iPLA2β的表達。在表達野生型p53的細胞系(U2OS, MCF7, A375, A549細胞)中，Nutlin或阿霉素處理后iPLA2β mRNA水平輕微但顯著上調(diào)，但在p53-null細胞系H1299中沒有上調(diào)(圖3a)。如圖3b所示，在親本細胞中，Nutlin處理誘導了iPLA2β的mRNA水平，而不是p53敲除細胞。此外，人類iPLA2β基因的啟動子區(qū)域包含三個可能的位點(RE1, RE2和RE3)，它們與一致的p53結(jié)合序列相匹配(圖3c)。事實上，p53特異性抗體的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析顯示，p53顯著募集到RE2和RE3，而不是RE1，其水平與TIGAR啟動子(眾所周知的p53代謝靶點)的水平相當(圖3d)。值得注意的是，當通過瞬時轉(zhuǎn)染野生型p53重建p53缺失H1299細胞時，iPLA2β mRNA的表達很容易被誘導，但沒有被三種腫瘤來源的DNA結(jié)合缺陷p53突變體(R175H, R273H，和R248W)誘導(圖3e)。

為了進一步了解這一調(diào)節(jié)的性質(zhì)，作者檢測了在p53介導的應(yīng)答過程中，相同處理的不同長度或不同劑量下的iPLA2β水平。在Nutlin處理后，iPLA2β水平在較早的時間點被誘導，但激活在較晚的時間點完全消失(圖4a, b)。相反，p53介導的p21在所有不同的時間點都被觀察到(圖4a)。p53對SLC7A11的下調(diào)在所有不同的時間點都保持不變(圖4a-c)。當細胞同時被Nutlin和TBH處理時，也獲得了類似的數(shù)據(jù)(圖4d-f)，同時用Nutlin和TBH處理，檢測p53介導的ferroptosis。此外，在HCT116細胞中，低劑量的DNA損傷試劑誘導了iPLA2β水平，但高劑量的相同試劑極大程度上消除了iPLA2β的激活，而p53介導的SLC7A11和p21在兩種條件下均保持完整(圖4g)。

圖4 p53介導的iPLA2β的不同效應(yīng)取決于應(yīng)激時間和強度

3. 在異種移植小鼠模型中，耗盡內(nèi)源性iPLA2β可使腫瘤細胞對ROS誘導的ferroptosis敏感，并增強p53依賴的腫瘤生長抑制

為了研究iPLA2β在調(diào)節(jié)p53功能中的作用，首先檢測了RNAi介導的內(nèi)源性iPLA2β敲低是否會影響人類黑色素瘤A375細胞中p53依賴性ferroptosis。Western blot分析顯示，siRNA介導的iPLA2β缺失并不影響p53或其轉(zhuǎn)錄靶p21的表達水平(圖5a)。轉(zhuǎn)染了對照siRNA的TBH處理的細胞很容易誘導p53介導的ferroptosis (圖5b)。然而，在野生型p53中，iPLA2β的消耗顯著增加了ferroptosis的水平(圖5b)，但在相同條件下，在p53陰性細胞中沒有觀察到顯著的影響(圖5b)，這表明iPLA2β可以抑制p53介導的ferroptosis。如圖5c所示，在MCF7細胞中，iPLA2β敲低顯著增強了p53介導的ferroptosis。與上述數(shù)據(jù)一致，iPLA2β表達的缺失對p53水平和p53轉(zhuǎn)錄功能沒有明顯影響(圖5d)，但在iPLA2β缺失的細胞中，p53介導的ferroptosis在不同時間點顯著升高(圖5e)。同樣，在U2OS細胞中，iPLA2β缺失可顯著增強p53介導的ferroptosis(圖6f)。

為了闡明iPLA2β在調(diào)控鐵下垂中的生理意義，檢測了iPLA2β表達的缺失是否會影響異種移植瘤模型中的腫瘤生長。在異種移植瘤生長試驗中，iPLA2β表達失活后，人類黑色素瘤A375異種移植瘤的生長顯著降低(2 vs. 1，圖6a, b)。然而，當使用同基因的p53-null A375細胞時，iPLA2β表達缺失誘導的腫瘤抑制作用很大程度上消失了(4 vs. 3，圖6a, b)。值得注意的是，在iPLA2β?/?腫瘤樣本中觀察到Ptgs2的上調(diào)，而在iPLA2β?/?/p53?/?樣本中沒有觀察到Ptgs2的上調(diào)(圖6c)。最后，為了進一步驗證這些觀察結(jié)果，在人肺癌A549細胞中進行了一系列上述類似的實驗。同樣，iPLA2β的缺失顯著增強了p53介導的ferroptosis (圖6d)。iPLA2β的失活也促進了p53-WT細胞的腫瘤抑制作用，而不是同基因的p53-null細胞(圖6e-g)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抑制iPLA2β表達顯著增強了p53介導的ferroptosis，并且通過iPLA2β的缺失激活ferroptosis至少在一定程度上有助于體內(nèi)p53依賴的腫瘤生長抑制。

圖5 iPLA2β作為p53介導的ferroptosis的主要抑制因子

圖6 iPLA2β作為p53介導的腫瘤抑制因子的主要抑制因子

4. iPLA2β下調(diào)ROS誘導的過氧化物膜脂水平，有效抑制p53誘導的ferroptosis

將ALOX12單獨或同時編碼ALOX12和iPLA2β的表達載體轉(zhuǎn)染U2OS細胞(圖7a)，并用C11-BODIPY染色，并通過流式細胞儀檢測細胞膜內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化水平。如圖7b、c所示，ALOX12表達顯著提高了過氧化物脂質(zhì)水平;然而，在iPLA2β共表達時，這些升高的水平有效地降低了。由于p53介導的鐵下垂獨立于GPX4(圖1d)，作者檢測了iPLA2β是否也能在GPX4缺失的細胞中調(diào)節(jié)p53介導的ferroptosis。為此，我們用編碼iPLA2β或iPLA2γ的表達載體轉(zhuǎn)染ACSL4/ GPX4缺失的U2OS細胞(圖7d)，并用C11-BODIPY染色的流式細胞儀分析脂質(zhì)過氧化水平。如圖7e所示，在ACSL4/ GPX4缺失細胞中，ROS脅迫下p53激活引起的脂質(zhì)過氧化水平升高(I)通過表達iPLA2β (II)顯著降低，但iPLA2γ表達沒有降低(III，圖7e)。p53-介導GPX4缺失的細胞中，iPLA2β的過表達完全消除了ferroptosis，而iPLA2γ的表達卻不能消除ferroptosis(圖7f)。因此，iPLA2β通過不依賴GPX4的方式降低脂質(zhì)過氧化水平，從而抑制p53介導的ferroptosis。

接下來，進行了靶向脂質(zhì)組學，監(jiān)測由iPLA2β調(diào)節(jié)的過氧化物脂質(zhì)的水平。事實上,水平的氧化磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰膽堿(PC) (oxPE (18:0/22:4) sn2或oxPC (18:0/20:4) sn2)顯著誘導ALOX12表達式,表明ALOX12在人癌細胞中生成氧化PE和氧化PC中起關(guān)鍵作用, 然而，氧化磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰膽堿(PC) (oxPE (18:0/22:4)sn2或oxPC (18:0/20:4)sn2)的水平在iPLA2β表達后顯著降低，但不包括酶缺陷突變體iPLA2β (G517C)(圖7 g, h)。與這些觀察結(jié)果一致的是，這種酶缺陷突變體iPLA2β (G517C)也未能抑制p53介導的ferroptosis (圖7i)。這些數(shù)據(jù)表明，ALOX12和iPLA2β在調(diào)控氧化磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰膽堿(PC)的水平中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

在FSP1缺失的細胞中，p53介導的ferroptosis很容易被誘導，更重要的是，在這些細胞中，iPLA2β有效地抑制了細胞死亡(圖8a, b)。iPLA2β在正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)條件下的ferroptosis反應(yīng)中不是必需的，但在應(yīng)激反應(yīng)中對控制脂質(zhì)過氧化水平和ferroptosis至關(guān)重要(圖8c)。表達較高水平iPLA2β的癌癥患者的總生存期明顯較短(圖8d, e)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明iPLA2β介導的作用與GPX4或FSP1完全無關(guān)。

圖7 iPLA2β介導抑制p53和ROS應(yīng)激誘導的脂質(zhì)過氧化和ferroptosis的機制

圖8 ALOX12和iPLA2β在p53介導的ferroptosis調(diào)控中的作用

總結(jié)：

研究表明，iPLA2β是激活ferroptosis介導的腫瘤抑制的一個有前途的治療靶點，且不存在嚴重的毒性問題。

參考文獻：

Chen D, Chu B, Yang X, Liu Z, Jin Y, Kon N, Rabadan R, Jiang X, Stockwell BR, Gu W. iPLA2β-mediated lipid detoxification controls p53-driven ferroptosis independent of GPX4. Nat Commun. 2021, 12(1):3644. doi: 10.1038/s41467-021-23902-6. PMID: 34131139; PMCID: PMC8206155.