一類(lèi)新的tsRNA標(biāo)記作為胰腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物
胰腺癌（PC）是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因，大多數(shù)PC患者在確診后都已進(jìn)展到晚期。因此對(duì)早期診斷和預(yù)后具有高敏感性和特異性的新型生物標(biāo)志物的鑒定是目前提高PC治療效果的最佳策略。最近有研究發(fā)表一種tsRNA譜可以作為早期診斷和/或預(yù)測(cè)PC的臨床結(jié)果的指標(biāo)，該研究于2021年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。
技術(shù)路線：
主要結(jié)果：
為了探究血清tsRNA是否可以作為PC的新生物標(biāo)志物，作者通過(guò)小RNA測(cè)序進(jìn)行初步篩選，然后在個(gè)體基礎(chǔ)上進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。首先，從30例PC患者和30例健康對(duì)照者血清中提取RNA進(jìn)行測(cè)序。長(zhǎng)度分析顯示，兩組RNA的分布不同(圖S1A)。在檢測(cè)到的433個(gè)tsRNA和1121個(gè)miRNAs中，與健康對(duì)照組相比，PC組中tsRNA的變異更大(圖1A, B)，這表明tsRNA可能是檢測(cè)PC更敏感的生物標(biāo)志物。分析結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，PC血清中有26個(gè)顯著差異的tsRNA (圖1 C)。采用絕對(duì)定量和相對(duì)比較的方法，在24名健康對(duì)照和24名PC患者的個(gè)體血清樣本中，驗(yàn)證前10位上調(diào)tsRNA中的6個(gè)候選基因的差異表達(dá)。與健康對(duì)照組相比，PC血清中6種tsRNA中有4種顯著升高(圖1D)。相對(duì)比較分析顯示，6個(gè)tsRNAs中有2個(gè)(tRF-Pro-AGG-004, tRFLeu- CAG-002)在PC患者中顯著增加(圖S2)。然后評(píng)估了兩種tsRNA對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)的影響，ROC分析顯示，tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu –CAG-002具有更高的AUC(圖S3)。總之，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為PC檢測(cè)的候選。
圖S1 PC患者和正常健康對(duì)照組血清中小RNA的分析
圖S3血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ROC曲線
2. 血清tsRNAs差異表達(dá)對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值
接下來(lái)，在兩家醫(yī)院的血清樣本中進(jìn)一步分析了這兩種tsrna的表達(dá)。與對(duì)照組相比，PC血清中tsRNAs顯著升高。采用ROC分析確定2- tsRNAs譜的診斷價(jià)值。這兩種tsrna單獨(dú)在AUC下顯示出較高的診斷價(jià)值(tRF-Pro-AGG-004: 0.90;tRF-Leu-CAG-002: 0.78)和性能(tRF-Pro-AGG-004:敏感性72.5%，特異性98.8%;tRF-Leu-CAG-002:敏感性64%，特異性77.2%)(圖1F)。在聯(lián)合分析中，與單個(gè)tsRNA相比，2個(gè)tsRNA的特征具有更高的AUC和更高的性能 (圖1G)。ROC分析顯示，2-tsRNAs特征比CA19-9和CEA（臨床PC生物標(biāo)志物CA19-9和CEA）具有更高的診斷潛力(圖1G)。有趣的是，2-tsRNAs組合對(duì)早期PC患者(I期和II期)的診斷準(zhǔn)確率明顯更高，AUC為0.84，敏感性為75.0%，特異性為83.0%(圖1H)，優(yōu)于CA19-9(敏感性63.5%，特異性59.6%)和CEA(敏感性63.1%，特異性58.5%)。此外，在其他類(lèi)型的疾病(包括HCC、BRC、NSCLC等)中檢測(cè)tRF-Pro-AGG-004和tRF-LEU-CAG-002的表達(dá)，表明聯(lián)合的2-tsRNAs特征在PC中具有一定的疾病特異性(圖1I)。這些結(jié)果表明，血清tRFPro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002即使在早期也可以作為診斷PC的新型生物標(biāo)志物。
圖1從PC患者血清樣本中鑒定出新的tsRNA生物標(biāo)志物
3. 血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織
為了確定PC血清中兩種tsRNAs的高水平是否是由PC組織中的擾動(dòng)引起的，首先檢查了獨(dú)立臨床隊(duì)列中相同患者的組織和配對(duì)血清中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的水平，并觀察到正相關(guān)(圖2A)。為了進(jìn)一步探討PC細(xì)胞是否釋放出增加的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002，在不同時(shí)間段的PANC1培養(yǎng)基中研究了tsRNAs的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)與細(xì)胞數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間成正比(圖2B)。此外，細(xì)胞中兩種tsRNAs抑制劑處理后，培養(yǎng)基中tsRNAs水平降低(圖2C)，說(shuō)明培養(yǎng)基中的tsRNAs直接從PC細(xì)胞中釋放出來(lái)。tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的定量顯示，與對(duì)照組小鼠相比，PC小鼠的腫瘤組織和血清標(biāo)本中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的表達(dá)顯著升高(圖2D)。此外，兩種tsRNAs的血清水平與腫瘤重量之間存在顯著正相關(guān)(圖2E)。綜上所述，這些結(jié)果表明，血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織。
作者還檢測(cè)了循環(huán)tsRNA的存在形式，并分別從PC患者血清、PC小鼠血清和PANC1細(xì)胞培養(yǎng)基的外泌體和無(wú)外泌體上清中分離出總RNA。有趣的是，結(jié)果顯示，tRF-Pro-AGG-004在無(wú)外泌體的上清中高度富集，而tRF-Leu-CAG-002優(yōu)先存在于外泌體中(圖2F)。兩種循環(huán)tsRNA的不同形式表明了它們不同的作用和系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制。
4. PC患者腫瘤組織中2個(gè)tsRNAs標(biāo)記的預(yù)后潛力
傳統(tǒng)的病理分期系統(tǒng)在預(yù)測(cè)預(yù)后方面可能已經(jīng)達(dá)到了極限，而新的分子生物標(biāo)志物可能會(huì)增加價(jià)值。因此，作者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)流程的ISH分析對(duì)2個(gè)臨床PC隊(duì)列中的2 - tsRNAs表達(dá)進(jìn)行檢查和評(píng)分。結(jié)果顯示，與正常組織相比，PC組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002顯著上調(diào)(圖S6)。當(dāng)根據(jù)生存時(shí)間將患者分為較短生存組和較長(zhǎng)生存組時(shí)，較短生存組的tsRNAs均顯著升高(圖2G, H, J)。設(shè)置ISH的最佳臨界值時(shí)(ISH分?jǐn)?shù)>3為高，ISH分?jǐn)?shù)<3低)，tRF-Pro-AGG-004高和/或tRF-Leu-CAG-002高的PC患者的預(yù)后明顯更差(圖2I, K)。這些結(jié)果提示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評(píng)分可以作為預(yù)測(cè)患者術(shù)后生存時(shí)間的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。
圖2 tsRNAs在腫瘤組織升高作為預(yù)測(cè)PC患者生存時(shí)間的獨(dú)立指標(biāo)
5. 胰腺癌中被血管生成素切割的tsRNAs增加
為了進(jìn)一步探討這兩種tsRNAs產(chǎn)生的機(jī)制，利用IHC芯片檢測(cè)了60對(duì)PC腫瘤和正常組織中參與tsRNAs加工的主要酶，包括ANG和Dnmt2。34/60例(56.7%)PC患者ANG明顯升高，而Dnmt2在兩組間無(wú)顯著差異(圖3A，圖S7)。TCGA分析也得到了類(lèi)似的結(jié)果(圖3B)。這些結(jié)果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002上調(diào)可能是ANG切割增加所致。ANG較高的PC患者總生存時(shí)間明顯縮短(圖3C)。轉(zhuǎn)染ANG siRNA導(dǎo)致PC細(xì)胞和培養(yǎng)基中tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的減少(圖3D)。此外，在PC原位移植腫瘤模型中，使用體內(nèi)優(yōu)化的RNAi去除ANG顯著降低了腫瘤和血清tsRNAs水平(圖3E-I)。這些結(jié)果表明，上調(diào)的tsRNAs可能是通過(guò)ANG的切割增加而產(chǎn)生的，ANG可能是PC治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
6. tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌中的作用
一些tsRNAs可能在結(jié)構(gòu)和功能上與miRNA相似，直接與靶mRNA結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制。通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估了兩種tsRNAs在胰腺癌中的功能意義。將感染的細(xì)胞皮下移植到六周大的裸鼠體內(nèi)。細(xì)胞植入后30天評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況(圖3J,K)。與對(duì)照組相比，tsRNA過(guò)表達(dá)組移植瘤的重量或體積更高或更大(圖3L,M)。此外，EdU檢測(cè)顯示，tsRNAs模擬物加速了PANC1的增殖，而抑制劑則延緩了細(xì)胞的增殖(圖3N)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)tsrna促進(jìn)細(xì)胞侵襲，而抑制兩種tsrna則抑制細(xì)胞侵襲(圖3O)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明這兩種tsRNAs在胰腺癌中起著腫瘤啟動(dòng)子的作用。
圖3兩種tsRNAs的產(chǎn)生機(jī)制和生物學(xué)功能
總結(jié)：
首先在PC患者中發(fā)現(xiàn)了一種新的血清雙tsRNAs特征。然后，證明即使在早期血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為新的有前景的生物標(biāo)志物用于PC診斷。此外，結(jié)果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評(píng)分可以作為預(yù)測(cè)患者術(shù)后生存時(shí)間的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。揭示了這兩種新的血清tsRNAs的起源、存在形式和潛在的生物學(xué)功能。需要進(jìn)行隨機(jī)臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估雙tsRNAs標(biāo)記在胰腺癌早期診斷和預(yù)后中的可能應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)：
Jin F, Yang L, Wang W, Yuan N, Zhan S, Yang P, Chen X, Ma T, Wang Y. A novel class of tsRNA signatures as biomarkers for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Mol Cancer. 2021, 20(1):95. doi: 10.1186/s12943-021-01389-5