一類新的tsRNA標記作為胰腺癌診斷和預(yù)后的生物標志物
胰腺癌（PC）是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因，大多數(shù)PC患者在確診后都已進展到晚期。因此對早期診斷和預(yù)后具有高敏感性和特異性的新型生物標志物的鑒定是目前提高PC治療效果的最佳策略。最近有研究發(fā)表一種tsRNA譜可以作為早期診斷和/或預(yù)測PC的臨床結(jié)果的指標，該研究于2021年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。
技術(shù)路線：
主要結(jié)果：
為了探究血清tsRNA是否可以作為PC的新生物標志物，作者通過小RNA測序進行初步篩選，然后在個體基礎(chǔ)上進行qRT-PCR驗證。首先，從30例PC患者和30例健康對照者血清中提取RNA進行測序。長度分析顯示，兩組RNA的分布不同(圖S1A)。在檢測到的433個tsRNA和1121個miRNAs中，與健康對照組相比，PC組中tsRNA的變異更大(圖1A, B)，這表明tsRNA可能是檢測PC更敏感的生物標志物。分析結(jié)果顯示，與健康對照組相比，PC血清中有26個顯著差異的tsRNA (圖1 C)。采用絕對定量和相對比較的方法，在24名健康對照和24名PC患者的個體血清樣本中，驗證前10位上調(diào)tsRNA中的6個候選基因的差異表達。與健康對照組相比，PC血清中6種tsRNA中有4種顯著升高(圖1D)。相對比較分析顯示，6個tsRNAs中有2個(tRF-Pro-AGG-004, tRFLeu- CAG-002)在PC患者中顯著增加(圖S2)。然后評估了兩種tsRNA對風(fēng)險評分預(yù)測的影響，ROC分析顯示，tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu –CAG-002具有更高的AUC(圖S3)?？傊?，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為PC檢測的候選。
圖S1 PC患者和正常健康對照組血清中小RNA的分析
圖S3血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ROC曲線
2. 血清tsRNAs差異表達對胰腺癌的診斷價值
接下來，在兩家醫(yī)院的血清樣本中進一步分析了這兩種tsrna的表達。與對照組相比，PC血清中tsRNAs顯著升高。采用ROC分析確定2- tsRNAs譜的診斷價值。這兩種tsrna單獨在AUC下顯示出較高的診斷價值(tRF-Pro-AGG-004: 0.90;tRF-Leu-CAG-002: 0.78)和性能(tRF-Pro-AGG-004:敏感性72.5%，特異性98.8%;tRF-Leu-CAG-002:敏感性64%，特異性77.2%)(圖1F)。在聯(lián)合分析中，與單個tsRNA相比，2個tsRNA的特征具有更高的AUC和更高的性能 (圖1G)。ROC分析顯示，2-tsRNAs特征比CA19-9和CEA（臨床PC生物標志物CA19-9和CEA）具有更高的診斷潛力(圖1G)。有趣的是，2-tsRNAs組合對早期PC患者(I期和II期)的診斷準確率明顯更高，AUC為0.84，敏感性為75.0%，特異性為83.0%(圖1H)，優(yōu)于CA19-9(敏感性63.5%，特異性59.6%)和CEA(敏感性63.1%，特異性58.5%)。此外，在其他類型的疾病(包括HCC、BRC、NSCLC等)中檢測tRF-Pro-AGG-004和tRF-LEU-CAG-002的表達，表明聯(lián)合的2-tsRNAs特征在PC中具有一定的疾病特異性(圖1I)。這些結(jié)果表明，血清tRFPro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002即使在早期也可以作為診斷PC的新型生物標志物。
3. 血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織
為了確定PC血清中兩種tsRNAs的高水平是否是由PC組織中的擾動引起的，首先檢查了獨立臨床隊列中相同患者的組織和配對血清中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的水平，并觀察到正相關(guān)(圖2A)。為了進一步探討PC細胞是否釋放出增加的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002，在不同時間段的PANC1培養(yǎng)基中研究了tsRNAs的表達。作者發(fā)現(xiàn)它們的表達與細胞數(shù)量和培養(yǎng)時間成正比(圖2B)。此外，細胞中兩種tsRNAs抑制劑處理后，培養(yǎng)基中tsRNAs水平降低(圖2C)，說明培養(yǎng)基中的tsRNAs直接從PC細胞中釋放出來。tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的定量顯示，與對照組小鼠相比，PC小鼠的腫瘤組織和血清標本中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的表達顯著升高(圖2D)。此外，兩種tsRNAs的血清水平與腫瘤重量之間存在顯著正相關(guān)(圖2E)。綜上所述，這些結(jié)果表明，血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于腫瘤組織。
作者還檢測了循環(huán)tsRNA的存在形式，并分別從PC患者血清、PC小鼠血清和PANC1細胞培養(yǎng)基的外泌體和無外泌體上清中分離出總RNA。有趣的是，結(jié)果顯示，tRF-Pro-AGG-004在無外泌體的上清中高度富集，而tRF-Leu-CAG-002優(yōu)先存在于外泌體中(圖2F)。兩種循環(huán)tsRNA的不同形式表明了它們不同的作用和系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制。
4. PC患者腫瘤組織中2個tsRNAs標記的預(yù)后潛力
傳統(tǒng)的病理分期系統(tǒng)在預(yù)測預(yù)后方面可能已經(jīng)達到了極限，而新的分子生物標志物可能會增加價值。因此，作者通過標準流程的ISH分析對2個臨床PC隊列中的2 - tsRNAs表達進行檢查和評分。結(jié)果顯示，與正常組織相比，PC組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002顯著上調(diào)(圖S6)。當根據(jù)生存時間將患者分為較短生存組和較長生存組時，較短生存組的tsRNAs均顯著升高(圖2G, H, J)。設(shè)置ISH的最佳臨界值時(ISH分數(shù)>3為高，ISH分數(shù)<3低)，tRF-Pro-AGG-004高和/或tRF-Leu-CAG-002高的PC患者的預(yù)后明顯更差(圖2I, K)。這些結(jié)果提示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評分可以作為預(yù)測患者術(shù)后生存時間的有價值的生物標志物。
圖2 tsRNAs在腫瘤組織升高作為預(yù)測PC患者生存時間的獨立指標
5. 胰腺癌中被血管生成素切割的tsRNAs增加
為了進一步探討這兩種tsRNAs產(chǎn)生的機制，利用IHC芯片檢測了60對PC腫瘤和正常組織中參與tsRNAs加工的主要酶，包括ANG和Dnmt2。34/60例(56.7%)PC患者ANG明顯升高，而Dnmt2在兩組間無顯著差異(圖3A，圖S7)。TCGA分析也得到了類似的結(jié)果(圖3B)。這些結(jié)果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002上調(diào)可能是ANG切割增加所致。ANG較高的PC患者總生存時間明顯縮短(圖3C)。轉(zhuǎn)染ANG siRNA導(dǎo)致PC細胞和培養(yǎng)基中tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的減少(圖3D)。此外，在PC原位移植腫瘤模型中，使用體內(nèi)優(yōu)化的RNAi去除ANG顯著降低了腫瘤和血清tsRNAs水平(圖3E-I)。這些結(jié)果表明，上調(diào)的tsRNAs可能是通過ANG的切割增加而產(chǎn)生的，ANG可能是PC治療的一個潛在靶點。
6. tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌中的作用
一些tsRNAs可能在結(jié)構(gòu)和功能上與miRNA相似，直接與靶mRNA結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制。通過體內(nèi)和體外實驗評估了兩種tsRNAs在胰腺癌中的功能意義。將感染的細胞皮下移植到六周大的裸鼠體內(nèi)。細胞植入后30天評估腫瘤生長情況(圖3J,K)。與對照組相比，tsRNA過表達組移植瘤的重量或體積更高或更大(圖3L,M)。此外，EdU檢測顯示，tsRNAs模擬物加速了PANC1的增殖，而抑制劑則延緩了細胞的增殖(圖3N)。Transwell實驗表明，過表達tsrna促進細胞侵襲，而抑制兩種tsrna則抑制細胞侵襲(圖3O)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明這兩種tsRNAs在胰腺癌中起著腫瘤啟動子的作用。
圖3兩種tsRNAs的產(chǎn)生機制和生物學(xué)功能
總結(jié)：
首先在PC患者中發(fā)現(xiàn)了一種新的血清雙tsRNAs特征。然后，證明即使在早期血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作為新的有前景的生物標志物用于PC診斷。此外，結(jié)果表明，腫瘤組織中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH評分可以作為預(yù)測患者術(shù)后生存時間的有價值的生物標志物。揭示了這兩種新的血清tsRNAs的起源、存在形式和潛在的生物學(xué)功能。需要進行隨機臨床試驗來評估雙tsRNAs標記在胰腺癌早期診斷和預(yù)后中的可能應(yīng)用。
參考文獻：
Jin F, Yang L, Wang W, Yuan N, Zhan S, Yang P, Chen X, Ma T, Wang Y. A novel class of tsRNA signatures as biomarkers for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Mol Cancer. 2021, 20(1):95. doi: 10.1186/s12943-021-01389-5