STK39通過磷酸化增加SNAI1活性促進乳腺癌的侵襲和轉移
SNAI1被廣泛認為是上皮-間充質(zhì)轉化(EMT)的主要驅動因子，與乳腺癌的進展和轉移有關。這種惡性前的作用與翻譯后修飾密切相關，特別是磷酸化，它控制其蛋白水平和亞細胞定位。雖然SNAI1穩(wěn)定性的調(diào)控涉及多種激酶，但SNAI1在腫瘤中穩(wěn)定的確切機制仍有待充分闡明。我們的研究表明STK39是SNAI1穩(wěn)定性的關鍵中介，并與轉移前細胞過程相關，突出了STK39-SNAI1信號軸作為轉移性乳腺癌治療的有希望的治療靶點。該文于2021年6月發(fā)表于Theranostics（IF= 11.556）雜志上。
技術路線
結果
通過質(zhì)譜分析我們注意到STK39是SNAI1作用的蛋白。為了研究這兩個蛋白之間的關系，我們在HEK293T細胞中共同表達了SNAI1和STK39。組成活性突變體STK39激酶(T243E/S383D, CA)顯著增加了SNAI1的表達，這表明STK39的酶活性對SNAI1的穩(wěn)定是必需的(圖1A)。STK39 WT和CA也增加了T-47D細胞內(nèi)源性SNAI1蛋白水平(圖1B)。然后我們用STK39抑制劑STOCK2S 26016 (STO)處理幾種乳腺癌細胞。STO處理顯著降低了SNAI1的表達(圖1C)。與此一致的是，在MDA-MB-231、MDA-MB-157和SUM 149細胞中，內(nèi)源性STK39的下調(diào)導致內(nèi)源性SNAI1蛋白的快速下降，但對mRNA水平?jīng)]有影響(圖1D和1E)。為了排除shRNA的脫靶效應，我們在shRNA介導的MDA-MB-157細胞中用抗shRNA的STK39挽救STK39的表達。如我們所料，STK39的異位表達恢復了SNAI1的表達(圖1F)。總之，我們的結果表明STK39穩(wěn)定SNAI1。
2）STK39通過阻斷SNAI1降解來提高SNAI1蛋白的穩(wěn)定性
由于SNAI1是一種易降解的蛋白質(zhì)，容易被蛋白酶體降解，因此我們想知道STK39是否阻斷了SNAI1的降解。首先，我們用蛋白酶體抑制劑MG132處理STK39敲低細胞，發(fā)現(xiàn)MG132處理后，STK39敲低的MDA-MB-231細胞中SNAI1的下調(diào)得以恢復(圖2A)，說明STK39敲低促進了SNAI1的降解。與此一致的是，MG132處理也恢復了STO處理的MDA-MB-231和MDA-MB-157細胞中SNAI1的表達(圖2B)。然后我們檢測SNAI1的降解。使用環(huán)己亞胺(CHX)阻斷新蛋白合成后，SNAI1在轉染對照載體的細胞中迅速降解(圖2C-2D)。然而，STK39存在時SNAI1水平穩(wěn)定，而CHX存在時這種效應持續(xù)了4 h。為了檢測內(nèi)源性SNAI1是否也受到STK39的類似調(diào)控，我們在MDA-MB-231細胞中敲除內(nèi)源性STK39，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性SNAI1變得不穩(wěn)定并迅速降解(圖2E-2F)。綜上所述，這些結果表明STK39通過阻斷SNAI1的降解而導致SNAI1的穩(wěn)定。
3）STK39與SNAI1相互作用，并使T203上的SNAI1磷酸化
為了描述STK39與SNAI1的相互作用，我們在HEK293T細胞中共表達Myc-STK39和HA-SNAI1，并進行了共同免疫沉淀(IP)實驗。在SNAI1的IP之后，我們檢測到一個相關的STK39，反之亦然(圖3A)。MDA- MB-231和MDA-MB-157細胞中內(nèi)源性SNAI1和STK39的IP也分別顯示內(nèi)源性STK39和SNAI1的存在(圖3B)。然后我們在HEK293細胞中共表達Myc-STK39和GFP-SNAI1。令人驚訝的是，STK39在細胞核中穩(wěn)定了SNAI1(圖3C)。雖然STK39主要定位于胞質(zhì)，但它包含一個假定的核定位信號，使核轉位。由于SNAI1在細胞核內(nèi)的翻轉減少，我們想知道STK39是否會使SNAI1在細胞核內(nèi)穩(wěn)定。為了驗證這種可能性，我們在T-47D細胞中過表達STK39，并將細胞分成胞質(zhì)和核部分。SNAI1蛋白僅在細胞核中檢測到，在T-47D細胞中SNAI1蛋白的增加主要是在細胞核中(圖3D)。然后我們篩選了可能促進SNAI1核保留的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點。結果表明T203是STK39的潛在靶位點(圖3E)。與此一致的是，STK39顯著提高了WT-SNAI1蛋白水平，但SNAI1-T203A的表達沒有顯著變化(圖3F)。此外，我們在轉染野生型SNAI1的HEK293T細胞中檢測到SNAI1磷酸化，但未檢測到SNAI1 T203A(圖3 G)。STK39-WT上調(diào)pT203-SNAI1，而STK39-KR不上調(diào)pT203-SNAI1。此外，MDA-MB-231和MDA-MB-157細胞中檢測到內(nèi)源性的pT203-SNAI1，而STK39的敲低顯著降低內(nèi)源性的pT203-SNAI1水平(圖3H)。這些結果表明STK39介導的T203磷酸化通過細胞核保留導致SNAI1穩(wěn)定，從而抑制SNAI1降解。
4）STK39以SNAI1依賴的方式增強EMT
為了探討STK39的功能作用，我們在兩種腔內(nèi)乳腺癌細胞系MCF7和T-47D中表達了STK39。STK39的表達誘導了這些細胞中SNAI1的穩(wěn)定和CDH1的下調(diào)(圖4A)。一致地，STK39的表達誘導了EMT的形態(tài)學改變(圖4B)，并伴有CDH1的下調(diào)。此外，RT-PCR顯示STK39表達下調(diào)了上皮標記物(CDH1, CLDN3和OCLN)，上調(diào)了間充質(zhì)分子Vimentin (VIM)的表達(圖4C)。在功能上，STK39的表達顯著增強了細胞遷移和侵襲能力(圖4D-4E)。這些功能需要STK39的催化活性，因為STK39-KR對這些細胞中的SNAI1表達、形態(tài)變化、細胞遷移和侵襲均無影響(圖4)。重要的是，SNAI1的下調(diào)顯著減弱了這些變化(圖4)，表明STK39促進的功能活動需要SNAI1上調(diào)。
5）下調(diào)STK39可抑制乳腺癌細胞EMT、遷移和侵襲
為了進一步研究STK39在乳腺癌中的作用，我們在MDA-MB-231和MDA-MB-157細胞中建立了STK39敲低的克隆。我們使用兩個獨立的shRNA實現(xiàn)了內(nèi)源性STK39 80-90%的敲除效率(圖5A)。在這兩個克隆中，STK39敲低增加了CDH1的水平，下調(diào)了N-cadherin的表達(圖5A)。STK39的缺失顯著增加了上皮標記物的mRNA表達水平(圖5B)。免疫熒光分析也提示CDH1上調(diào)，N-cadherin下調(diào)(圖5C)。STK39基因敲除極大地抑制了這些細胞的遷移和侵襲能力(圖5D-5E)。STK39敲除的克隆中SNAI1的表達在很大程度上恢復了STK39消融誘導的效應(圖5)。此外，TGF-β1處理誘導MCF10A細胞EMT并激活SNAI1表達(圖5F)。STK39缺失顯著抑制EMT和SNAI1的表達。綜上所述， STK39在很大程度上以SNAI1依賴的方式增強乳腺癌轉移。
6）STO表型復制STK39缺陷的影響
STO處理增加了CDH1的表達，下調(diào)了SNAI1的表達(圖6A)，且呈劑量依賴性(圖6B)。STO處理還上調(diào)了CDH1的水平，下調(diào)了N-cadherin的表達(圖6C)。免疫熒光分析進一步顯示CDH1升高，N-cadherin降低(圖6D)。與STK39缺陷相一致，STO處理可上調(diào)上皮標記物(圖6E)，并極大地抑制這些細胞的遷移和侵襲(圖6F-6G)?？傊?，用STK39抑制劑處理后，觀察到STK39表達缺失的效應；具體來說，包括遷移受損、SNAI1下調(diào)和CDH1表達增加，因此支持STK39激酶活性在EMT中發(fā)揮關鍵作用。
7）在體內(nèi)抑制STK39可使化療增敏并阻斷轉移
SNAI1與獲得耐藥相關。紫杉醇(PTX)是經(jīng)典的紫杉烷類藥物，用于乳腺癌治療。不幸的是，對患者有效和成功的治療通常受到獲得性耐藥性的限制。為了檢測STK39的下調(diào)是否會提高PTX的敏感性，我們測定了在STK39缺失或不缺失的情況下，PTX對MDA-MB-231和MDA-MB-157細胞株的IC50。STK39的缺失降低了PTX的IC50(圖7A)。為了確定STO是否與PTX有協(xié)同作用，我們用PTX處理MDA-MB-231和MDA-MB-157細胞。STO與PTX協(xié)同抑制細胞增殖(圖7B)。軟瓊脂菌落形成分析顯示，與PTX單獨處理相比，STO和PTX聯(lián)合處理在菌落形成和菌落大小上都有更大的降低(圖7C)。我們的數(shù)據(jù)表明，STK39抑制使乳腺癌細胞對PTX敏感。接著，為了直接評估STK39在體內(nèi)是否對細胞轉移至關重要，我們將STK39基因敲低的MDA-MB-231-熒光素酶細胞靜脈注射到雌性SCID小鼠中，并對這些小鼠進行生物發(fā)光成像(BLI)。所有的對照組小鼠由于大量肺轉移而死亡(圖7D)。相比之下，注射了STK39敲除細胞的小鼠是活的，沒有檢測到轉移。組織學分析顯示，對照細胞有大量轉移灶，而STK39敲除細胞缺乏轉移灶(圖7E-7F)。與體外SNAI1的功能一致，外源性SNAI1在STK39敲除細胞中的表達在很大程度上挽救了肺轉移的形成(圖7D-7F)。在乳腺癌中，SNAI1表達與無瘤生存率呈負相關。為了驗證表達高水平STK39的原發(fā)性乳腺癌患者是否比表達低水平STK39的乳腺癌患者復發(fā)更快，我們分析了兩個來自原發(fā)人乳腺癌的微陣列表達數(shù)據(jù)集。結果發(fā)現(xiàn)STK39高表達的個體的總生存率或無病生存間隔降低(圖7G)。這些結果表明STK39的表達可能是臨床環(huán)境中乳腺癌的重要預后指標。
結論：我們的研究揭示了STK39通過增強SNAI1的穩(wěn)定性促進腫瘤細胞EMT和轉移的機制。我們的研究也對STK39靶向治療轉移性癌癥具有重要意義。