心臟的護(hù)花使者——lncRNA LncHrt維持心臟代謝穩(wěn)態(tài)和功能

代謝調(diào)節(jié)是預(yù)防缺血性心臟不良重構(gòu)的一種有前途的治療方法。但對(duì)lncRNA在調(diào)節(jié)心臟代謝中的作用知之甚少，本文在心肌梗死(MI)小鼠模型中使用無偏轉(zhuǎn)錄組分析lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了一種新的心肌細(xì)胞豐富的lncRNA，稱為LncHrt，它可以調(diào)節(jié)導(dǎo)致心力衰竭的代謝和病理生理過程。總之，本文確定LncHrt是一種心臟代謝調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)下游代謝信號(hào)通路在維持心臟功能方面發(fā)揮重要作用。本文于2021年8月發(fā)表在《Basic Research in Cardiology》IF：17.165期刊上。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1、LncHrt是心肌梗死后下調(diào)的心肌細(xì)胞富集的lncRNA

為了探索心臟疾病中調(diào)控病理生理過程的關(guān)鍵lncRNA，對(duì)心肌梗死(MI)后3和14天的小鼠心臟進(jìn)行微陣列的轉(zhuǎn)錄組分析，以sham操作的小鼠做對(duì)照組，獲得3天和14天的差異表達(dá)lncRNA，并驗(yàn)證了5個(gè)在實(shí)驗(yàn)組最顯著下調(diào)的lncRNA的表達(dá)（圖1a-e）。 同時(shí)，作者在不同組織中檢測了這5個(gè)lncRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AK034241和XR_373578是特異性顯著富集于心臟組織，并且AK034241是心臟組織中5個(gè)lncRNA里最顯著的（圖1f-h）。因此，作者關(guān)注于AK034241并將其命名為lncRNA-heart（LncHrt）。

隨后作者探究了LncHrt在小鼠從出生到成年的心臟組織中的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出乎后第7天表達(dá)顯著升高，隨后急劇增加，表明它可能是成年心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需要的，此外，LncHrt同時(shí)平均分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的，其編碼蛋白的可能性非常低（圖1i-k）。人LncHrt的基因組位點(diǎn)是保守的，而LncHrt序列在多個(gè)物種中在外顯子1以及外顯子2的5?端和3?端高度保守（圖1l）。擴(kuò)張型心肌病患者LncHrt的人同源物的表達(dá)也減少（圖1m-n）。以上表明LncHrt可能在調(diào)節(jié)心臟疾病中發(fā)揮重要作用。

圖1 LncHrt是心肌梗死后下調(diào)的心肌細(xì)胞富集的lncRNA

2、敲除LncHrt損傷心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)

為了探究LncHrt的功能，實(shí)驗(yàn)AAV9-shRNA敲除新生兒小鼠中的LncHrt，即AAV-LncHrt KD。結(jié)果表明敲除LncHrt后，導(dǎo)致心臟擴(kuò)大，心臟重量與體重之比提高（HW/BW），而不影響體重（圖2a-e）。心電圖顯示LncHrt敲除后小鼠左心室收縮功能受損，縮短分?jǐn)?shù)下降，明顯的左心室擴(kuò)張和左心室后壁厚度減少（2f-i）。并且這些變化得到了心臟組織學(xué)和組織纖維化的結(jié)果的支持。與此相反，過表達(dá)LncHrt后對(duì)小鼠的心臟的影響與上述結(jié)果完全相反（圖3）。總之，以上結(jié)果表明敲除LncHrt損傷心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)，過表達(dá)LncHrt可保護(hù)心臟免受心肌梗死。

圖2 敲除LncHrt損傷心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)

圖3 AAV9傳遞的LncHrt過表達(dá)可保護(hù)心臟免受心肌梗死

3、心肌LncHrt過表達(dá)挽救心肌梗死的轉(zhuǎn)錄組

為了探究LncHrt的分子機(jī)制，作者對(duì)LncHrt過表達(dá)的MI發(fā)生7天后的心臟組織和對(duì)照組進(jìn)行了基因組RNA測序，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs）。KEGG分析顯示這些上調(diào)的DEGs主要富集到代謝相關(guān)通路，如代謝通路、碳代謝、氧化磷酸化、TCA循環(huán)、糖酵解、脂肪酸代謝等，下調(diào)的DEGs則顯著富集于心臟病理通路，如ECM-受體相互作用和焦點(diǎn)粘連。GO分析也表明上調(diào)DEGs顯著富集于代謝過程和心臟肌肉組分，下調(diào)DEGs則富集在免疫系統(tǒng)過程和炎癥響應(yīng)等（圖4a-e），表明LncHrt過表達(dá)可能通過介導(dǎo)心臟代謝途徑改善MI發(fā)生后的心功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，對(duì)LncHrt過表達(dá)的MI發(fā)生7天后的心臟組織和對(duì)照組進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，得出了與上述研究類似的結(jié)果（圖4f-h）?？傊?，這些結(jié)果表明心肌LncHrt過表達(dá)挽救心肌梗死的轉(zhuǎn)錄組通過心臟代謝途徑。

圖4心肌LncHrt過表達(dá)挽救心肌梗死的轉(zhuǎn)錄組

4、LncHrt改善心肌梗死后心臟代謝穩(wěn)態(tài)

通過RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)LncHrt在MI后調(diào)控代謝過程，因而作者思考LncHrt如何在心臟重構(gòu)和應(yīng)激反應(yīng)中緩解心臟代謝應(yīng)激，改善代謝表型（圖5a）。研究發(fā)現(xiàn)，LncHrt敲除導(dǎo)致線粒體的氧通路增強(qiáng)，脂肪酸氧化顯著提高，氧化磷酸化增加，呼吸作用復(fù)合體增加（圖5b-f）。這些研究表明心臟LncHrt過表達(dá)改善心肌梗死后心臟氧化磷酸化代謝能力。此外，考慮到MI后氧氣供應(yīng)減少，葡萄糖利用代謝轉(zhuǎn)變，作者檢測了葡萄糖關(guān)鍵酶蛋白HK1，PGK1，和能量代謝酶CS，IDH2的表達(dá)。結(jié)果顯示，他們的表達(dá)在LncHrt過表達(dá)后顯著上調(diào)（圖5g-h）。此外，LncHrt過表達(dá)也顯著增加了ATP水平（圖5i）。而敲除LncHrt則導(dǎo)致線粒體氧代謝的指標(biāo)顯著下降（圖5j-m）?？傊@些結(jié)果表明LncHrt能保持心肌代謝穩(wěn)態(tài)，改善心肌梗死后的心功能。

圖5 LncHrt改善心肌梗死后心臟代謝穩(wěn)態(tài)

5、LncHrt通過與SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信號(hào)通路

為了闡明LncHrt在MI反應(yīng)中調(diào)節(jié)心肌代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，首先探究LncHrt是否可能調(diào)節(jié)其鄰近基因Klhl33的表達(dá)，但是過表達(dá)LncHrt對(duì)其體內(nèi)外的表達(dá)沒有影響，于是作者探究了其相互作用的蛋白。質(zhì)譜和pull-down聯(lián)合分析初步鎖定了LncHrt與SIRT2的相互作用關(guān)系（圖6a-c）。反過來，LncHrt也在SIRT2的免疫磁珠中顯著富集（圖6d-e）。表明LncHrt與SIRT2的相互作用。

然后研究這種相互作用的功能相關(guān)性。先前的研究表明，SIRT2使下游激酶LKB1去乙?；?，促進(jìn)LKB1的磷酸化，隨后激活LKB1-AMPK信號(hào)通路。這一途徑通過保存肥大心臟中AMPK的活性來保護(hù)心臟。研究發(fā)現(xiàn)LncHrt過表達(dá)促進(jìn)LKB1磷酸化，從而導(dǎo)致下游的激酶AMPK在Thr172位點(diǎn)磷酸化（圖6f-g），相反LncHrt敲除減少LKB1和AMPK的磷酸化抑制LKB1-AMPK信號(hào)（與6h-i）。這些數(shù)據(jù)是由基因集富集分析LncHrt過表達(dá)的心臟RNA-seq數(shù)據(jù)支持，LKB1-AMPK通路對(duì)mTOR的能量依賴性調(diào)節(jié)被富集(圖6j)。綜上所述，這些研究表明LncHrt與SIRT2相互作用，通過調(diào)節(jié)梗死心臟中LKB1-AMPK信號(hào)通路來調(diào)節(jié)其功能。

圖6 LncHrt通過與SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信號(hào)通路

6、LncHrt通過阻斷CDK5對(duì)SIRT2的抑制來維持SIRT2活性

由于LncHrt保留了SIRT2的活性并促進(jìn)了下游激酶的活性，進(jìn)一步探究LncHrt如何影響SIRT2上游信號(hào)以正向調(diào)節(jié)其活性。研究發(fā)現(xiàn)LncHrt不影響Sirt2轉(zhuǎn)錄水平或蛋白表達(dá)，因?yàn)樵贚ncHrt功能獲得或功能喪失模型中中Sirt2沒有改變（圖7a-e）。鑒于此前一項(xiàng)研究揭示p35-Cdk5在有絲分裂后細(xì)胞中通過S331磷酸化抑制SIRT2催化活性的翻譯后機(jī)制。作者推測CDK5轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)SIRT2，并抑制了LKB1-AMPK活性。作者發(fā)現(xiàn)LncHrt下調(diào)促進(jìn)了CDK5和SIRT2之間的相互作用，隨后，提高了LKB1的賴氨酸乙?；?，導(dǎo)致LKB1活性及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)的破壞（圖7f-i）。這一觀察結(jié)果排除了LncHrt直接調(diào)節(jié)CDK5表達(dá)的想法。

最后，探究CDK5耗盡是否會(huì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞中LKB1-AMPK信號(hào)下游的SIRT2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除CDK5會(huì)提高LKB1-AMPK信號(hào)，但是SIRT2抑制顯著阻斷了LKB1-AMPK信號(hào)的激活（圖7j-k）。因此， CDK5通過調(diào)節(jié)SIRT2活性介導(dǎo)LKB1-AMPK信號(hào)通路。LncHrt表現(xiàn)出心臟代謝保護(hù)，至少部分是通過干擾SIRT2的催化活性，導(dǎo)致LKB1-AMPK信號(hào)激活。

圖7 LncHrt通過阻斷CDK5對(duì)SIRT2的抑制來維持SIRT2活性

7、LncHrt對(duì)梗死心臟的治療潛力

在證明LncHrt可以保護(hù)心臟免受心肌梗死損傷后，接下來探討LncHrt是否可以作為治療梗死心臟的潛在治療靶點(diǎn)。MI后向心肌內(nèi)注射AAV9-LncHrt或AAV9-CTRL，并持續(xù)監(jiān)測LncHrt的表達(dá)，直至其在兩組間表現(xiàn)出顯著差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncHrt敲除后改善了心臟的形態(tài)，顯著降低了HW/BW比值（圖8a-b）。注射2周后，LncHrt敲除改善了心臟功能，表現(xiàn)為縮短分?jǐn)?shù)增加，心室內(nèi)經(jīng)減?。▓D8c-e）。組織學(xué)也表明LncHrt敲除后心臟組織的病理性變化顯著減少（圖8f-j）。此外，敲除LncHrt后心臟代謝內(nèi)穩(wěn)態(tài)也得到恢復(fù)，表現(xiàn)在氧通量，呼吸作用和ATP等（圖8k-o）?？傊?，這些表明LncHrt對(duì)梗死心臟的有治療潛力。

圖8 LncHrt對(duì)梗死心臟的治療潛力

本文鑒定了一種名為LncHrt的新型心肌細(xì)胞富集的lncRNA，它作為心臟代謝的重要調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。LncHrt是MI反應(yīng)中下調(diào)最多的lncRNA，對(duì)心臟穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因?yàn)長ncHrt的耗竭會(huì)損害心臟形態(tài)、代謝和功能。重要的是，心臟特異性過表達(dá)LncHrt通過表達(dá)參與代謝信號(hào)和肌肉收縮的基因保護(hù)MI后的心臟。LncHrt過表達(dá)，心臟中轉(zhuǎn)錄組的改變補(bǔ)償了MI誘導(dǎo)的代謝信號(hào)的失調(diào)。此外，lncRNA與代謝偶聯(lián)的機(jī)制是通過SIRT2-LKB1-AMPK軸介導(dǎo)的，這為lncRNA可以影響代謝信號(hào)級(jí)聯(lián)提供了證據(jù)（圖9）。總之，該研究確定LncHrt是一種新型的心臟lncRNA，并揭示了lncRNA在病理應(yīng)激后維持心臟代謝穩(wěn)態(tài)中未被認(rèn)識(shí)的作用。

圖9 LncHrt在心肌梗死中的作用機(jī)制的工作模型

參考文獻(xiàn)：

Liu Ning., Kataoka Masaharu., Wang Yingchao., Pu Linbin., Dong Xiaoxuan., Fu Xuyang., Zhang Feng., Gao Feng., Liang Tian., Pei Jianqiu., Xiao Changchen., Qiu Qiongzi., Hong Tingting., Chen Qiming., Zhao Jing., Zhu Lianlian., He Junhua., Hu Xiaoyun., Nie Yu., Zhu Wei., Yu Hong., Cowan Douglas B., Hu Xinyang., Wang Jian'an., Wang Da-Zhi., Chen Jinghai.(2021). LncRNA LncHrt preserves cardiac metabolic homeostasis and heart function by modulating the LKB1-AMPK signaling pathway. Basic Res Cardiol, 116(1), 48. doi:10.1007/s00395-021-00887-3