國自然熱點之外泌體

外泌體是胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外的膜性小囊泡，是細(xì)胞間信號傳輸?shù)妮d體。外泌體最近幾年受到廣泛關(guān)注，成為生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的新寵兒。文章發(fā)表數(shù)目飛速增長，外泌體成為研究熱點是大致可以認(rèn)為從2014年開始。2013年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予美國科學(xué)家詹姆斯·羅思曼、蘭迪·謝克曼及德國科學(xué)家托馬斯·祖德霍夫，以表彰其在細(xì)胞間囊泡運輸調(diào)控機制領(lǐng)域作出突出貢獻(xiàn)，將外泌體研究的熱度推向高潮。2020年外泌體相關(guān)課題中標(biāo)兩千余項。

但是現(xiàn)階段的外泌體研究主要是與其他研究熱點結(jié)合例如，miRNA、lncRNA、circRNA。今天講一下外泌體相關(guān)研究。這篇文獻(xiàn)題目為：Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma。該文章主要講述了外泌體circ_0072083通過調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-1252-5p介導(dǎo)的降解和去甲基化來增加NANOG表達(dá)，從而促進(jìn)TMZ抗性。

circ_0072083 豐度在 TMZ 抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中增加

證實替莫唑胺（TMZ，膠質(zhì)瘤化療藥）抗性組織的 MGMT 啟動子甲基化比例低于 TMZ 敏感樣品。為了探討circ_0072083 是否參與膠質(zhì)瘤中的TMZ抗性，測量了circ_0072083在抗性和敏感組織中的表達(dá)變化。TMZ 抗性組織（n ?= 36）中的circ_0072083 豐度高于敏感組織（n ?= 33）。此外，構(gòu)建了TMZ抗性細(xì)胞系（U251/TR和U87/TR），其 TMZ的IC50 高于敏感細(xì)胞。circ_0072083在抗性細(xì)胞（U251/TR和U87/TR）中的豐度比敏感細(xì)胞（U251和U87）增加了2 倍以上。此外，還分析circ_007208的信息和結(jié)構(gòu)CircView軟件顯示circ_0072083 是ZFR轉(zhuǎn)錄本的外顯子 2 與外顯子20的反向剪接產(chǎn)生的。此外，在兩種細(xì)胞系中，circ_0072083對放線菌素D和RNase R的抗性比相應(yīng)的線性RNA更強，表明 circ_0072083 的圓形結(jié)構(gòu)。此外，circ_0072083主要在U251/TR和U87/TR細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。為了抑制細(xì)胞中的circ_0072083，構(gòu)建了三種靶向 circ_0072083 剪接點的siRNA，并證實了它們的功效。

circ_0072083 敲低降低了 TMZ 抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的 TMZ 抗性

為了研究circ_0072083對TMZ抗性的作用，用sh-circ_0072083或sh-NC 轉(zhuǎn)染U251/TR和U87/TR細(xì)胞。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sh-circ_0072083是基于具有最高敲低效率的si-circ_0072083#1序列構(gòu)建的。sh-circ的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞中circ_0072083 水平降低 65% 以上。circ_0072083 敲低明顯降低了 U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞中TMZ的IC50。接下來，在用TMZ (50 μg/mL) 處理的細(xì)胞中進(jìn)行功能分析。在TMZ存在的情況下，circ_0072083沉默通過降低增殖和集落形成的能力顯著抑制細(xì)胞增殖。此外，在TMZ存在下，circ_0072083干擾明顯增加了U251/TR和U87/TR細(xì)胞的凋亡。此外，敲低circ_0072083顯著削弱了通過TMZ攻擊的兩種細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。此外，在異種移植模型中研究了 circ_0072083對 TMZ 功效的影響。用sh-circ_0072083或sh-NC轉(zhuǎn)染U251/TR細(xì)胞建立異種移植模型，然后用TMZ（20mg/kg）或PBS處理小鼠。與 sh-NC + TMZ 組相比，sh-circ + TMZ 組的腫瘤體積和重量明顯減少。此外，與 sh-NC + TMZ 組相比，sh-circ_0072083 + TMZ 組中的 circ_0072083 豐度顯著降低。這些結(jié)果表明，circ_0072083 沉默減弱了膠質(zhì)瘤中的 TMZ 抗性。

circ_0072083 沉默通過調(diào)節(jié) ALKBH5 介導(dǎo)的 TMZ 抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的去甲基化抑制 NANOG 水平

為了探索ALKBH5和NANOG是否需要通過circ_0072083調(diào)節(jié)TMZ抗性，在TMZ抗性組織和細(xì)胞中檢測了它們的水平。與敏感組相比，TMZ抗性組織和細(xì)胞中ALKBH5和NANOG mRNA水平顯著升高。與敏感組相比，TMZ抗性組的NANOG mRNA m6A水平明顯降低。此外，在TMZ抗性組織和細(xì)胞中，ALKBH5和NANOG蛋白水平明顯增加。并且使用sh-ALKBH5轉(zhuǎn)染通過 ALKBH5沉默顯著降低了NANOG 表達(dá)。RIP分析顯示NANOG可以在 U251/TR和U87/TR 細(xì)胞中被 ALKBH5 富集。此外，ALKBH5沉默明顯增強了NANOG mRNA的m6A水平并降低了響應(yīng)放線菌素D的NANOG mRNA穩(wěn)定性。此外，在 U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞中評估了circ_0072083對ALKBH5 和NANOG表達(dá)的影響。結(jié)果表明，circ_0072083 沉默顯著降低了ALKBH5和 NANOG 的豐度，并增加了 NANOG mRNA 的 m6A 水平。顯示多蛋白復(fù)合物（METTL3、METTL14 和 WTAP）介導(dǎo) NANOG mRNA 的 m6A 修飾以誘導(dǎo)其降解。circ_0072083 可以上調(diào) ALKBH5 表達(dá)，其介導(dǎo) NANOG mRNA 3'UTR 的去甲基化，導(dǎo)致NANOG mRNA 穩(wěn)定性增加。這些數(shù)據(jù)表明circ_0072083可以通過調(diào)節(jié)ALKBH5介導(dǎo)的去甲基化來調(diào)節(jié)NANOG的表達(dá)。

circ_0072083 與 miR-1252-5p 相互作用以調(diào)節(jié) TMZ 抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的 ALKBH5/NANOG 軸和 TMZ 抗性

為了分析circ_0072083如何調(diào)節(jié)ALKBH5/NANOG軸，探索了潛在的 miRNA作為串?dāng)_。基于Circinteractome和starBase的數(shù)據(jù)庫，維恩圖顯示只有一種miRNA（miR-1252-5p）可以與circ_0072083、ALKBH5和NANOG結(jié)合。 miR-1252-5p 表達(dá)在 TMZ 抗性組織和細(xì)胞中顯著降低。為了驗證它們的相互作用，構(gòu)建了野生型和突變型熒光素酶報告載體。miR-1252-5p 過表達(dá)明顯降低了野生型組（WT-circ_0072083、WT-NANOG 3'UTR 和 WT-ALKBH5 3'UTR）的熒光素酶活性，而沒有改變突變組（MUT -circ_0072083，MUT-NANOG 3'UTR 和 MUT-ALKBH5 3'UTR）。此外，Ago2 RIP 分析表明 miR-1252-5p、circ_0072083、ALKBH5 和 NANOG 可以在同一復(fù)合物上富集。此外，在U251/TR和U87/TR 細(xì)胞中，通過circ_0072083 沉默，miR-1252-5p 水平明顯增強。miR-1252-5p 過表達(dá)顯著降低了 U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞中的 ALKBH5 和 NANOG 水平。此外，在用 sh-NC + anti-NC、sh-circ_0072083 + anti-NC 或 sh-circ_0072083 + anti-miR-1252-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中研究了 circ_0072083/miR-1252-5p 軸對 ALKBH5 和 NANOG 水平的影響。ALKBH5和NANOG 水平通過circ_0072083沉默顯著降低，這通過miR-1252-5p 敲低恢復(fù)。此外，miR-1252-5p 敲低逆轉(zhuǎn)了 circ_0072083沉默介導(dǎo)的 TMZ IC50 降低、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及促進(jìn) U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明 circ_0072083 可以調(diào)節(jié) miR-1252-5p/ALKBH5/NANOG 軸以控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的 TMZ 抗性。

外泌體circ_0072083的分泌依賴于TMZ抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Warburg效應(yīng)

為了探索circ_0072083是否通過外泌體攜帶，從TMZ抗性和敏感細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離外泌體。外泌體通過TEM 確認(rèn)。大小主要在 100-200 nm，抗性細(xì)胞比敏感細(xì)胞具有更高濃度的外泌體。外泌體還通過特定標(biāo)記物（CD63、CD81 和 TSG101）鑒定。此外，與 U251 和 U87 細(xì)胞相比，U251/TR 和 U87/TR 細(xì)胞中的外泌體 circ_0072083 水平明顯升高。此外，在抗性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了比敏感細(xì)胞更高的 Warburg 效應(yīng)，這通過乳酸產(chǎn)生、葡萄糖攝取和關(guān)鍵酶（GLUT1、LDHA 和 PKM2）水平的增加來揭示。此外，抑制Warburg 效應(yīng)（紫草素）顯著降低了外泌體濃度和外泌體 circ_0072083 水平，但促進(jìn) Warburg 效應(yīng)（TNF-α）起到了相反的作用。此外，外泌體濃度與葡萄糖濃度和 Warburg 效應(yīng)水平呈正相關(guān)。先前的報告表明，表皮生長因子 (EGF) 和齊墩果酸 (OA) 可以增強或抑制外泌體分泌。在這里，發(fā)現(xiàn)了EGF和OA促進(jìn)或抑制U251 / TR和U87 / TR細(xì)胞Warburg效應(yīng)。此外，EGF 介導(dǎo)的外泌體分泌促進(jìn)通過抑制 Warburg 效應(yīng)（紫草素）而減輕；和 OA 介導(dǎo)的外泌體分泌抑制通過促進(jìn) Warburg 效應(yīng)（TNF-α）被逆轉(zhuǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，在 TMZ 抗性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中外泌體 circ_0072083 的釋放取決于 Warburg 效應(yīng)。

來自抗性細(xì)胞的外泌體circ_0072083促進(jìn)敏感神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的TMZ抗性

為了研究外泌體circ_007208對TMZ抗性的作用，從U251/TR和U87/TR細(xì)胞敲低circRNA中分離外泌體，并與 U251 和 U87 細(xì)胞一起孵育。外泌體circ_0072083水平在轉(zhuǎn)染sh-circ的U251/TR和U87/TR細(xì)胞培養(yǎng)基中明顯降低。與PBS組相比，U251/TR-sh-NC EXO和U87/TR-sh-NC EXO孵育后U251和U87細(xì)胞中circ_0072083、ALKBH5和NANOG水平顯著升高，miR-1252-5p表達(dá)降低，而這些事件通過 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 處理的細(xì)胞中的 circ_0072083 下調(diào)而減弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的孵育顯著增強了 U251 和 U87 細(xì)胞中 TMZ 的 IC50，這通過 circ_0072083 敲低而減弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的引入在TMZ (50 μg/mL) 處理下明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并抑制U251和U87細(xì)胞的凋亡，但這些U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 組中的 circ_0072083 沉默緩解了事件。

通過U251細(xì)胞異種移植模型研究了外泌體circ_0072083對體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響。通過 PBS + TMZ (20 mg/kg)、U251/TR-sh-NC EXO (10 μg) + TMZ (20 mg/kg) 或 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO (10 μg) 處理異種移植小鼠+ TMZ（20 mg/kg）。通過添加 U251/TR-sh-NC EXO 顯著增加了腫瘤體積和重量，而通過引入 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 可以減輕這種情況。此外，U251/TR-sh-NC EXO+TMZ組腫瘤組織中circ_0072083、ALKBH5和NANOG的豐度明顯增加，miR-1252-5p表達(dá)降低，而這些事件在U251/TR-sh中逆轉(zhuǎn)-circ_0072083 EXO + TMZ 組。這些結(jié)果表明外泌體 circ_0072083 增加了敏感細(xì)胞中的 TMZ 抗性。

外泌體circ_0072083與膠質(zhì)瘤患者的TMZ耐藥、診斷和生存有關(guān)

為了分析外泌體 circ_0072083 在膠質(zhì)瘤患者中的價值，從患者的血清樣本中分離外泌體。通過 TEM 和特定標(biāo)記物（CD63、CD81 和 TSG101）驗證外泌體。此外，大小主要在100-200 nm，并且在耐藥患者中其濃度更高。此外，與TMZ敏感患者（n ?=33）相比，TMZ耐藥患者（n =36）的外泌體circ_0072083水平顯著上調(diào)。此外，通過將這些外泌體暴露于不同條件來評估外泌體 circ_0072083 的穩(wěn)定性，結(jié)果表明 TMZ 耐藥患者中外泌體 circ_0072083 的豐度不受不同孵育時間和不同 pH 值的顯著影響。此外，外泌體 circ_0072083 可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的獨立診斷靶標(biāo)（AUC= 0.85，P ?< 0.05），并且外泌體 circ_0072083 水平高的患者總生存率較低（P ?< 0.05）。?根據(jù)平均水平將患者分為高（n ?= 36）或低（n = 33）外泌體circ_0072083組。桌子表格11總結(jié)出高外泌體circ_0072083水平與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤大小、晚期WHO分級、MGMT甲基化和TMZ抗性相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明外泌體circ_0072083在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中具有重要作用。這表明外泌體circ_0072083可以通過在Warburg效應(yīng)下調(diào)節(jié)ALKBH5介導(dǎo)的去甲基化來調(diào)節(jié)miR-1252-5p/NANOG軸來增加膠質(zhì)瘤中的TMZ抗性。