維生素D-維生素D受體調(diào)控糖尿病小鼠腎小管上皮細胞的缺陷自噬

糖尿病腎病(DN)已成為終末期腎病的主要病因之一，自噬障礙與DN的發(fā)病機制有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)維生素D (VD)和VDR(維生素D受體)通過抑制炎癥和纖維化發(fā)揮腎保護作用。然而，VD-VDR是否調(diào)節(jié)DN患者的自噬障礙尚不清楚。在本研究中，我們建立了鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的VDR敲除(VDR-KO)小鼠和VDR特異性過表達(VDR-OE)小鼠的糖尿病模型。結(jié)果表明，paricalcitol(一種激活的維生素D類似物)或VDR-OE均能減輕STZ誘導(dǎo)的白蛋白排泄、腎小管損傷和炎癥，而VDR-KO小鼠的這些癥狀均加重。STZ小鼠腎臟存在自噬缺陷，VDR-KO小鼠的自噬缺陷更明顯，paricalcitol或VDR-OE可部分修復(fù)。在高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞中，觀察到自噬缺陷和PRKAA1/AMPK磷酸化降低，paricalcitol可通過VDR依賴的方式部分恢復(fù)PRKAA1/AMPK磷酸化。AMPK抑制劑可消除paricalcitol誘導(dǎo)的自噬激活，AMPK激活劑可修復(fù)高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞的缺陷自噬。此外，paricalcitol介導(dǎo)的AMPK激活可被CAMKK2/CaMKKβ抑制消除，而STK11/LKB1敲除不能。同時，paricalcitol可以挽救高糖誘導(dǎo)的Ca2+濃度下降。該文于2021年8月發(fā)表于Autophagy（IF= 16.016）雜志上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）VD-VDR延遲DN進展

誘導(dǎo)12周后，STZ誘導(dǎo)的糖尿病WT小鼠出現(xiàn)蛋白尿，而pari治療阻斷了STZ誘導(dǎo)小鼠的蛋白尿，而不改變血糖水平或體重。同時，在STZ誘導(dǎo)下，VDR-KO小鼠比WT小鼠出現(xiàn)更嚴重的蛋白尿(圖1A)。PAS染色顯示STZ治療后腎小管不同程度的部分擴張，近端腎小管上皮細胞(PTECs)扁平，刷狀邊界減少，VDR-KO進一步惡化，pari治療部分阻止(圖1B)。另一方面，VDR-OE減少了STZ誘導(dǎo)的蛋白尿，而不影響體重和血糖水平(圖1C)。PAS染色顯示WT+STZ和OE+STZ小鼠近端小管上皮細胞均不同程度扁平，OE+STZ小鼠表現(xiàn)出部分減弱的PAS陽性染色和管狀損傷(圖1D)。

2）VD-VDR可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟炎癥

由于炎癥在DN的發(fā)展中起重要作用，我們評估了VD-VDR對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠炎癥的影響。巨噬細胞浸潤標志物ADGRE1/F4/80在VDR-KO小鼠和STZ誘導(dǎo)的糖尿病WT小鼠中升高。ADGRE1在KO+STZ小鼠中增長最為顯著，在WT+STZ+pari組中明顯受到抑制(圖2A)。RT-PCR顯示，VDR-KO小鼠和STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中促炎細胞因子(CCL2/MCP-1和TNF/TNF- α)的表達明顯高于WT小鼠。這種增長在KO+STZ小鼠中最為強勁。此外，pari部分恢復(fù)了促炎細胞因子的增加(圖2B)。與WT和VDR-OE小鼠相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病WT小鼠ADGRE1、CCL2和TNF的表達均增加。VDR過表達明顯降低了炎癥浸潤，OE+STZ小鼠的炎癥因子表達低于WT+STZ小鼠(圖2C,D)。

3）VD-VDR可緩解糖尿病小鼠腎臟異常自噬體積聚

我們利用透射電子顯微鏡(TEM)檢查糖尿病小鼠腎臟的變化。與WT小鼠相比，WT+STZ小鼠腎小管上皮細胞中發(fā)現(xiàn)更多的自噬空泡，糖尿病VDR-KO小鼠中發(fā)現(xiàn)最多的自噬空泡(圖3A,D)。為了進一步證實這些發(fā)現(xiàn)，我們檢測了自噬的關(guān)鍵標記LC3的表達。如圖3B和3E所示，STZ處理后小鼠LC3- II增加，KO+STZ組這種作用更明顯，pari處理恢復(fù)了STZ誘導(dǎo)的LC3變化。為了進一步驗證，我們對自噬體進行了免疫熒光染色。STZ小鼠LC3斑點增多，KO+STZ小鼠LC3斑點增多更為明顯，pari處理小鼠LC3斑點減少(圖3C,F)。為了探究自噬空泡和LC3數(shù)量的增加是否表明自噬激活或自噬降解受損，我們檢測了自噬底物SQSTM1。如圖3B和3E所示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的SQSTM1表達高于WT小鼠，表明STZ誘導(dǎo)的小鼠存在自噬缺陷。Pari部分恢復(fù)了缺陷自噬，因為它降低了STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中SQSTM1的表達。此外，STZ處理后VDR-KO小鼠的自噬缺陷水平高于對照小鼠，而OE+STZ小鼠未見SQSTM1聚集。我們的數(shù)據(jù)表明，STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎臟的自噬是有缺陷的，可以通過VD-VDR部分恢復(fù)。

4）VD可修復(fù)高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞自噬缺陷

我們探討了pari對體外DN細胞自噬和炎癥的影響。我們用高水平葡萄糖(HG)處理HK-2細胞。如圖4A所示，在高糖條件下，LC3-II和SQSTM1的表達增加，在自噬抑制劑氯喹(CQ)作用下，LC3-II和SQSTM1的表達進一步增加。此外，我們使用tf-LC3研究自溶酶體的成熟過程。在酸性溶酶體環(huán)境中，mCherry比GFP更穩(wěn)定，自溶酶體的正常成熟以增加僅紅點為特征。與此相反，GFP和mCherry斑點共定位表明自噬通量中斷，呈現(xiàn)黃色斑點。高糖誘導(dǎo)mCherry和GFP共定位，CQ處理更明顯(圖4C)。這些結(jié)果進一步表明，高糖可損害自噬通量。另一方面，與HG組相比，paricalcitol降低了LC3-II和SQSTM1的表達，增加了僅紅色的斑點(圖4B,C)。為了研究缺陷性自噬是否有助于高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，采用實RT-qPCR檢測促炎因子(CCL2, TNF, IL6)的mRNA水平。結(jié)果顯示CQ加重了高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而paricalcitol降低了促炎因子的表達(圖4D)，說明HK-2細胞高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)部分是由于自噬缺陷引起的，paricalcitol可以恢復(fù)自噬通量，減少炎癥反應(yīng)。

5）VD通過激活AMPK通路恢復(fù)了缺陷的自噬通量

有報道稱，高糖誘導(dǎo)的自噬變化與AMPK密切相關(guān)。為了探討paricalcitol誘導(dǎo)HK-2細胞自噬的分子機制，我們研究了AMPK-ULK1激酶網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)。如圖5A所示，在高糖條件下，PRKAA1/AMPKα1的磷酸化水平降低，而paricalcitol處理則逆轉(zhuǎn)它的表達。在PRKAA1抑制劑復(fù)合物C的存在下，paricalcitol誘導(dǎo)的自噬激活被抑制(圖5A)。相反，二甲雙胍，PRKAA1激活劑，可降低高糖誘導(dǎo)的LC3-II、SQSTM1和炎癥水平(圖5B,C)。這些結(jié)果表明，AMPK激活是paricalcitol誘導(dǎo)的高糖條件下自噬激活和炎癥抑制的關(guān)鍵機制。

6）VD以VDR依賴的方式調(diào)控AMPK

由于維生素D通過VDR發(fā)揮其最大的生物學(xué)作用，我們使用HK-2 VDR KO細胞研究VD是否通過VDR激活AMPK。結(jié)果表明，paricalcitol增加了PRKAA1和ULK1的磷酸化，而在高糖條件下則降低了PRKAA1和ULK1的磷酸化。而在HK-2 VDR KO細胞中，這種作用完全消失(圖6A)。此外，二甲雙胍在高糖條件下激活了HK-2 WT細胞中的PRKAA1和ULK1，但二甲雙胍的這種作用在HK-2 VDR KO細胞中仍然可以觀察到(圖6B)。這些結(jié)果表明VD以VDR依賴的方式激活AMPK。

7）VD通過Ca2+-CAMKK2途徑調(diào)控AMPK

AMPK通過上游激酶磷酸化激活，主要包括STK11/LKB1和CAMKK2/CaMKKβ。為了確定AMPK激酶是否參與paricalcitol介導(dǎo)的AMPK激活，我們使用STO- 609(選擇性CAMKK抑制劑)、CAMKK2 siRNA和HK-2 STK11 KO細胞。如圖7A和7B所示，與STO-609或CAMKK2 siRNA共同處理完全消除了paricalcitol刺激的PRKAA1和ULK1磷酸化。然而，paricalcitol能夠激活HK-2 STK11 KO細胞中的PRKAA1和ULK1(圖7C)。這些結(jié)果表明paricalcitol通過CAMKK2激活AMPK。由于CAMKK2主要受細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。為了闡明Ca2+信號在paricalcitol介導(dǎo)作用中的參與，我們使用熒光Ca2+探針Fluo 4AM評估了細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化對paricalcitol處理的響應(yīng)。如圖7D所示，當(dāng)HK2細胞暴露于高糖環(huán)境時，Ca2+濃度下降，paricalcitol可以緩解這種下降。

8）VDR激活STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠AMPK

為了進一步證實VD-VDR對高糖環(huán)境下AMPK激活的影響，我們檢測了STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠AMPK- ULK1的磷酸化水平。如圖8所示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠PRKAA1和ULK1磷酸化水平降低，KO+STZ小鼠的這種變化更明顯。此外，paricalcitol或VDR過表達促進PRKAA1和ULK1磷酸化，盡管WT+STZ組和OE+STZ組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖8A,C)。我們還通過免疫熒光染色檢測了p-PRKAA1的水平，其變化趨勢與蛋白印跡相似(圖8B,D)。結(jié)合圖3E的結(jié)果，我們推測在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎臟中，VDR需要VD激活才能有效磷酸化PRKAA1，然后調(diào)節(jié)自噬(圖3E和8A,B)。綜上所述，VD-VDR通過激活AMPK-ULK1通路恢復(fù)了stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟缺陷的自噬。

   結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟中存在缺陷自噬，VD-VDR部分恢復(fù)了缺陷自噬并減少了炎癥。機制研究表明，AMPK參與了高糖誘導(dǎo)的缺陷自噬和炎癥，VD刺激的AMPK磷酸化是由于CAMKK2激活響應(yīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度增加。我們的結(jié)果闡明了VD-VDR在DN中腎保護作用的新機制。