HIF-2α激活通過增加細胞內(nèi)的鐵來增強結腸癌細胞的氧化死亡

結腸癌(CRC)是世界上第三常見的癌癥，也是癌癥相關死亡的主要原因。癌細胞迅速擴張，所有實體瘤由于血管化不足而經(jīng)歷缺氧。缺氧是實體腫瘤的一個標志，它促進細胞生長、生存和轉移，并對化療和放療產(chǎn)生耐藥性。缺氧反應主要由轉錄因子缺氧誘導因子1α (HIF-1α)和HIF-2α介導，而HIF-1α和HIF-2α在CRC中表現(xiàn)出不同的作用。我們的研究表明，癌癥細胞依賴于HIF-2α的一種機制脆弱性，可用于CRC治療。該研究2021年6月發(fā)表在《JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》，IF為14.808。

技術路線：

主要研究結果：

1. 藥物篩選確定腫瘤類腸道中HIF-2α的合成易損性

作者構建Apc缺失型（Cdx2-ERT2Cre；Apc^fl/^fl）和CRC HIF-2α過表達小鼠模型（Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF-2α^LSL/^LSL），從這2個小鼠模型中分離腸類藥物，并用化療藥物培養(yǎng)，生長被監(jiān)測了5天(圖1A)。在Cdx2-ERT2^Cre;在Apc^fl/^fl HIF-2α^LSL/^LSL小鼠中，他莫昔芬可誘導HIF-2α，并特異性地破壞結腸上皮細胞中的Apc。來自Cdx2-ERT2Cre；Apc^fl/^fl腫瘤腸系膜的小鼠對doxorubicin, mitoxantrone, irinotecan,以及 eribulin等藥物高度敏感，與來自Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF2α^LSL/^LSL的不同（圖1B）。RSL3、sorafenib索拉菲尼、erastin和DMF被認為是最有效的小分子，可以顯著降低Cdx2-ERT2^Cre；Apc^fl/^fl HIF2α^LSL/^LSL腫瘤腸道類物質的生長（圖1C）。Erastin和RSL3是經(jīng)典的ferroptosis激活劑，分別抑制xCT(由Slc7a11基因編碼，是xC系統(tǒng)的一個組成部分)和GPX4。DMF一種細胞可滲透的線粒體衍生物，在一些癌癥細胞系中具有細胞毒性（圖1D）這些結果表明，HIF-2α表達的腫瘤可以被氧化應激激活劑選擇性靶向。

圖1 篩選能抑制過表達HIF-2α的腫瘤腸樣細胞生長的化合物

2. 在CRC細胞中，HIF活化與鐵死亡的激活劑協(xié)同作用

Erastin和RSL3是經(jīng)典的鐵死亡誘導劑，作者已證明，缺氧模擬FG4592或缺氧顯著增強了鐵死亡誘導物erastin和RSL3以HIF-2α依賴的方式處理后的細胞死亡。作者在最后一次給藥后14天，分析這些小鼠的結腸組織的組織學變化(圖2A)。Slc7a11的缺失或HIF-2α的過度表達與對照動物的情況無法區(qū)分（圖2B）。然而，Slc7a11的破壞與HIF-2α過表達聯(lián)合導致結腸上皮變性和空泡化(圖2B)。通過4-羥基2-壬烯醛(4-HNE)染色測定脂質過氧化誘導的氧化應激(圖2C)。與對照組相比，Villin-CreER^T2Slc7a11^fl / ^fl; HIF-2α^LSL/^LSL小鼠的組織學評分(圖2D)和4-HNE強度(圖2E)均顯著增加，表明這些小鼠氧化應激和上皮細胞損失增加。此外，與對照組比較，Villin-CreER^T2-HIF-2α^LSL/^LSL小鼠的HILPDA和PLIN2 mRNA水平顯著升高(圖2F)。與對照組相比，Villin-CreER^T2-HIF-2α^LSL/^LSL小鼠肝臟和腸道鐵水平都更高(圖2G)。肝臟鐵含量的增加是由于小腸對鐵的吸收增加。這些數(shù)據(jù)證實了HIF-2α在體內(nèi)對鐵死亡敏感的作用，并提示誘導鐵死亡的藥物可能對缺氧細胞有很高的殺傷效果。

圖2. HIF-2α激活可增強體內(nèi)鐵死亡

3. HIF激活可促進DMF誘導的CRC細胞死亡

作者的篩選鑒定出DMF是一種小分子，可以有效地減少低氧腫瘤腸道樣體的生長（圖1C）。一組CRC細胞系使用DMF單獨或聯(lián)合缺氧或模擬缺氧FG4592處理。通過MTT和長期克隆生存試驗評估，FG4592增強DMF誘導的CRC細胞死亡(圖3,A- C)。此外，DMF處理和缺氧培養(yǎng)的細胞存活率較低(圖3,D和E)。與erastin和RSL3數(shù)據(jù)一致，HIF-2α是促進DMF介導的CRC細胞生長的關鍵(圖3F)。

圖3. 缺氧模擬有助于DMF誘導的CRC細胞生長抑制

4. DMF獨立于鐵死亡誘導細胞死亡

由于DMF與其他細胞對鐵死亡激活劑一起有效地降低了缺氧細胞的生長(圖1C)，我們評估了DMF是否介導了鐵死亡激活劑的死亡。在DMF處理后，Fer-1和Lip-1不能挽救細胞的死亡和活力，而rsl3介導的細胞死亡被Fer-1和Lip-1挽救(圖4A)。在DMF處理后，Fer-1和Lip-1不能挽救細胞的死亡和活力，而RSL3介導的細胞死亡被Fer-1和Lip-1挽救(圖4A)。DMF可與抗氧化劑GSH直接反應，導致NADPH降低，ROS增強。然而，FG4592和糖酵解抑制劑的共同作用并沒有降低細胞活力(圖4E)。這些結果表明，在DMF介導的缺氧腫瘤細胞死亡中有其他機制參與。

圖4. DMF在CRC細胞中不是鐵轉移誘導物。

5. 在DMF誘導的HIF-2α介導的細胞死亡中，活性氧積累和鐵毒性是必不可少的

添加半胱氨酸前體n -乙酰半胱氨酸(NAC)的生長培養(yǎng)基挽救了含或不含FG4592 DMF處理的HCT116和SW480細胞的死亡和活力(圖5A和補充圖9C)。在DMF處理和維持缺氧的細胞中也觀察到類似的結果(圖5B)。FG4592或單獨的缺氧處理增加了ROS，這是通過細胞滲透的2,7 -二氯二氫熒光素二醋酸酯(H2DCFDA)評估的，它被用作ROS的指標(圖5,C和D)。與DMF的協(xié)同處理增強了ROS生成的增加，而NAC可以挽救ROS生成(圖5,C和D)。為了證實對氧化細胞死亡的敏感性是由HIF-2α介導的，利用了shRNA介導的HIF-1α和HIF-2α敲低細胞。HIF-2α敲低細胞中的ROS水平顯著降低(圖5E)，表明DMF處理后HIF-2α在ROS產(chǎn)生中的作用。

由于HIF激活會導致線粒體代謝的變化和ROS的產(chǎn)生，作者分析了DMF或FG4592處理是否會引起線粒體代謝物池的變化。然而，線粒體代謝物水平未見顯著變化，表明HIF-2α通過其他機制影響細胞ROS(圖5F)。由DMF和FG4592介導的細胞死亡在低鐵和對照培養(yǎng)基中被挽救(圖5G)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，鐵毒性通過HIF-2α和氧化應激脆弱性的機制。

圖5. 活性氧的產(chǎn)生和鐵的積累參與DMF和FG4592介導的CRC細胞死亡

6. H₂S的保護性過硫化作用可以挽救DMF和HIF-2α誘導的細胞死亡

接下來，評估了不可逆的蛋白質氧化是否參與了DMF和FG4592誘導的細胞死亡。H₂S可通過過硫化作用(翻譯后修飾)防止半胱氨酸硫醇的過度氧化(圖6A) 為了排除H₂S的保護作用不是由于DMF上的硫化物陰離子親核添加導致的DMF消耗，在DMF和FG4592或DMF和缺氧導致細胞死亡16小時后，將Na₂S和3-MP添加到新鮮培養(yǎng)基中（圖6B）。即使在這些條件下，Na₂S和3-MP也能防止細胞死亡(圖6,C和D)。此外，補充3-MP和Na₂S后，DMF或DMF和FG4592誘導的細胞內(nèi)ROS水平降低(圖6E)。這些數(shù)據(jù)與模型一致，即DMF增強HIF誘導的細胞死亡涉及氧化蛋白損傷，而氧化蛋白損傷受到H₂S的保護。

圖6. H₂S可防止不可逆的蛋白質氧化，挽救DMF和FG4592介導的細胞死亡

7. FG4592增強DMF介導的體內(nèi)CRC細胞死亡

接下來，作者評估了DMF和FG4592聯(lián)合治療已建立的CRC腫瘤的體內(nèi)療效。此，HCT116、SW480和DLD1細胞被皮下植入免疫缺陷小鼠的側壁，并在DMF和FG4592治療前建立10天(圖7A)。從與接受對照或單獨藥物治療的患者相比，在所有3個異種移植中，DMF和FG4592治療的腫瘤體積(圖7B)和腫瘤重量(圖7C)均顯著減少。通過BrdU摻入試驗評估的腫瘤細胞增殖在DMF和FG4592聯(lián)合處理的HCT116、SW480和DLD1異種移植中也降低了(圖7D)。然而，在與DMF和FG4592共同處理的所有3個異種移植物中，tunel陽性凋亡細胞的百分比都有所增加(圖7E)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，缺氧腫瘤細胞對DMF治療非常脆弱，突出了一個潛在的治療窗口。

圖7. DMF和FG4592增強體內(nèi)CRC細胞死亡

8. DMF介導的體內(nèi)CRC細胞死亡依賴于HIF-2α

為了證實HIF-2α在DMF介導的體內(nèi)CRC細胞死亡中的作用，利用HIF-2α敲低HCT116細胞。在DMF和FG4592治療前，將穩(wěn)定的非靶標擾亂和HIF-2α敲低的HCT116細胞皮下注射到免疫受損小鼠的兩側，并允許其生長10天(圖8A)。HIF-2α基因敲低的細胞對DMF和FG4592處理具有抗性。在DMF+FG4592處理的小鼠中，表達雜亂shRNA的細胞顯示腫瘤體積和重量顯著減少，而HIF-2α敲低的細胞則完全耐受(圖8,B和C)。同樣，在DMF+FG4592處理后，HIF-2α敲低細胞的腫瘤增殖和凋亡沒有改變(圖8,D和E)。這些數(shù)據(jù)表明，HIF-2α激活增加了體內(nèi)氧化細胞死亡的脆弱性。

圖8. DMF介導的體內(nèi)CRC細胞死亡依賴于HIF-2α

總結：

該研究揭示了HIF-2α在驅動低氧CRC細胞對氧化應激誘導化合物(如DMF)的合成致命性方面的作用，并揭示了利用這種內(nèi)在脆弱性進行化療發(fā)展的潛力。