5'-tRF-GlyGCC: 一種tRNA衍生的小RNA，作為結(jié)直腸癌診斷的新生物標(biāo)志物

       tRNA衍生的小RNA (tDRs)廣泛分布于血液和尿液等人體組織中，在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。然而，tDRs在結(jié)直腸癌(CRC)血漿中的表達(dá)及其潛在的診斷價(jià)值尚未得到系統(tǒng)的探討。目前有作者發(fā)現(xiàn)血漿中5'-tRF-GlyGCC的表達(dá)水平是一種很有前景的CRC診斷生物標(biāo)志物，該研究于2021年2月發(fā)布在《Genome Medicine》，IF：10.675。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 大腸癌CRC和健康志愿者HC血漿中tDRs的表達(dá)譜

為了研究tDRs在CRC和HC血漿中的表達(dá)譜，作者使用小RNA高通量測序分析了3名CRC和3名HC受試者血漿樣本(表S1)中10 - 50 bp范圍內(nèi)的小RNA (smRNA)。分析表明，在HCs和CRC血漿中，tDRs的豐度按5’-tRF>5’-half/i-tRF>3’-tRF>3’-half的順序降低（圖1a）。此外，大腸癌血漿中5-tRF的比例顯著高于HCs（圖1a），表明5’-tRF可能參與大腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。進(jìn)一步分析單個tDR譜的表達(dá)。分層聚類顯示HCs和HCs之間血漿中tDR表達(dá)存在系統(tǒng)性差異（圖1b），分別在CRC和HCs中獲得628和745個tDR。進(jìn)一步分析CRC和HC血漿中5 -tRFs的差異。結(jié)果顯示，CRC血漿中的5' -tRF譜與HC血漿中的5 ’-tRF譜有較大差異(圖1c)。例如，HC和CRC血漿中5’ -tRF豐度最高的分別是5’ -tRF- HISGTG和5’ -tRF- GLYGCC。5’-tRF- GLYGCC在HC血漿中占5’ -tRF的7.44%，而在CRC血漿中占5’ -tRF的52.24%。此外，5’-tRF-GlyCCC在CRC血漿中的比例明顯升高;而5’-tRF-HisGTG和5’-tRF-AlaTGC在CRC血漿中的比例明顯降低(圖1c)。所有這些數(shù)據(jù)表明5’-tRFs在CRC血漿中與在HC中有顯著差異。

在CRC和HC鑒定的628個和745個tDR中，每組分別有85個和202個tDR(圖1d)。此外，CRC患者血漿中81個tDR較HC患者明顯增加(圖1d)。為了驗(yàn)證小RNA測序結(jié)果，對上述3例CRC和3例HC受試者血漿樣本中5例上調(diào)的候選tDR進(jìn)行了qRT-PCR檢測。如圖1e所示，CRC血漿中測量到的tDRs均較HC升高，其中5’-tRF-GlyGCC的升高幅度最大。所有這些數(shù)據(jù)表明，與HC相比，CRC患者血漿中tDRs的表達(dá)譜存在差異;此外，5’-tRF，特別是5’-tRF- glygcc在CRC血漿中顯著升高。

表S1小RNA測序樣本的背景信息

圖1 tDR在CRC和HC血漿中的表達(dá)譜

2. CRC患者血漿中5'-tRF-GlyGCC水平

5’-tRF-GlyGCC位于第1、2、6、16、17染色體上，轉(zhuǎn)錄本長度為31 nt，序列為5’-GCA UGG GUG GUU CAG UGG UAG AAU UCU CGC C-3’ (MINTbase Unique ID: tRF-35- PNR8YP9LON4VN1)。小RNA-seq數(shù)據(jù)提示5’-tRF-GlyGCC在CRC患者中的升高高于其他tDR。進(jìn)一步檢測了其在CRC (n = 105)和HC (n = 90)患者血漿中的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)顯示，5’-tRF-GlyGCC在CRC患者中的豐度明顯高于HC (圖2)。然后分析了5’-tRF-GlyGCC在CRC患者不同病理階段(I期，n = 11;階段II, n = 34;III期，n = 32;IV期，n = 25)。結(jié)果表明，CRC各階段5’-tRF-GlyGCC含量均高于HC (圖2 b)。結(jié)果表明5’-tRF-GlyGCC可能是一種有前景的診斷CRC患者的生物標(biāo)志物。

5’-Trf-GlyGCC的表達(dá)隨著CRC進(jìn)展而增加(圖2b)。此外，5’-tRF-GlyGCC在I/II期CRC患者中的豐度明顯低于III/IV期患者(圖2c)。轉(zhuǎn)移組患者血漿5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于無轉(zhuǎn)移組(圖2 d)。CEA≥5 ng/ml組的5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于CEA < 5 ng/ml(圖2e)。CRC患者CA199≥37 IU/ml的5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于CA199 <37 IU/ml(圖2f)。結(jié)果顯示，CRC患者血漿中5’-tRF-GlyGCC水平與CEA(圖2g)和CA199(圖2h)水平顯著正相關(guān)。5’-tRF-GlyGCC在結(jié)直腸癌患者血漿中上調(diào)，并隨著結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移而升高。

收集16對腫瘤組織和血漿樣本，驗(yàn)證5’-tRF-GlyGCC在CRC組織和相同患者血漿中的表達(dá)是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示5’-tRF-GlyGCC在血漿中的表達(dá)與配對CRC組織中的表達(dá)顯著相關(guān)(圖2i)。提示血漿中5’-tRF-GlyGCC水平較高的患者在結(jié)直腸癌組織中5’-tRF-GlyGCC水平也較高。

圖2 CRC患者血漿5’-tRF-GlyGCC水平

3. 5’-tRF-GlyGCC作為CRC患者的biomarker的診斷價(jià)值

為了檢測血漿5’-tRF-GlyGCC水平是否對CRC患者具有診斷價(jià)值，ROC曲線以確定臨界值。從圖3a看出，血漿5’-tRF-GlyGCC含量可以區(qū)分CRC患者和HC，曲線下面積(AUC)為0.882。5’-tRF-GlyGCC的最佳截?cái)嘀禐?.9725(敏感性86%，特異性72%)(圖3b)。結(jié)果表明，5’-tRF-GlyGCC的診斷價(jià)值遠(yuǎn)高于CEA (AUC 0.762)和CA199(0.557)。此外，5’-tRF-GlyGCC、CEA和CA199組合的ROC曲線將AUC值提高到0.926 (圖3 c)。聯(lián)合的最佳臨界值為3.1273(敏感性86，特異性84%)(圖3d)。這說明血漿5’-tRF-GlyGCC水平對CRC患者具有良好的診斷能力。

圖3 5’-tRF-GlyGCC作為CRC患者的biomarker的診斷價(jià)值

4. ALKBH3參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發(fā)生

LKBH3是一個tRNA去甲基化酶，僅被鑒定為誘導(dǎo)tDRs的生成。為了研究ALKBH3是否參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發(fā)生。首先，檢測5’-tRF-GlyGCC和ALKBH3在9種人CRC細(xì)胞系和人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在大多數(shù)測量的CRC細(xì)胞系中，5’-tRF-GlyGCC (圖4a)和ALKBH3 mRNA(圖4b)均顯著高于NCM460細(xì)胞。同樣，western blot分析證實(shí)，在CRC細(xì)胞中，ALKBH3蛋白表達(dá)上調(diào)(圖4c)。此外，5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)與測量的CRC細(xì)胞中ALKBH3的mRNA水平顯著正相關(guān)(圖4d)。

過表達(dá)ALKBH3可以增加5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)(圖4 E)。ALKBH3沉默降低了SW480、RKO和PENG-EBV細(xì)胞中5’-tRF-GlyGCC的水平(圖4f)。一致地，在RKO和SW480細(xì)胞中過表達(dá)ALKBH3可以增加5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)(圖S4 C)，而在HCT15和HCT116細(xì)胞中，抑制ALKBH3的表達(dá)可以降低5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)(圖S4 D)。證明了，tRNA去甲基化酶ALKBH3參與了CRC和血細(xì)胞中5’-tRF-GlyGCC的生物發(fā)生。

圖4 ALKBH3參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發(fā)生

5. 與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)可通過ALKBH3增加血細(xì)胞5’-tRF-GlyGCC

與所有檢測的CRC細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高PENG-EBV細(xì)胞中的5’-tRF-GlyGCC水平。與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高THP-1細(xì)胞中5’-tRF-GlyGCC水平(圖5b)。與所有CRC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，PENG-EBV細(xì)胞中ALKBH3 mRNA的表達(dá)也明顯增加(圖5c)。western blot分析證實(shí)，與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)提高了PENG-EBV細(xì)胞中ALKBH3蛋白的表達(dá)(圖5d)。

作者進(jìn)一步研究了ALKBH3是否參與CRC誘導(dǎo)的血細(xì)胞5’-tRF-GlyGCC。ALKBH3在PENG-EBV細(xì)胞中的表達(dá)被下調(diào)(圖5e)。結(jié)果表明，缺失ALKBH3可減弱SW620(圖5f)和SW480(圖5g)誘導(dǎo)的PENGE- EBV細(xì)胞中5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)。提示CRC細(xì)胞可通過上調(diào)ALKBH3上調(diào)外周血5’-tRF-GlyGCC水平。

圖5與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)可通過ALKBH3增加血細(xì)胞5’-tRF-GlyGCC

6. 異種移植的CRC腫瘤增加了小鼠血漿中5’-tRF-GlyGCC的水平

為了評價(jià)體內(nèi)CRC腫瘤對5’-tRF-GlyGCC表達(dá)的影響，使用BALB/c-nu-nu小鼠建立了人CRC HCT116異種移植瘤。與對照組相比，移植裸鼠血漿5’-tRF-GlyGCC水平顯著升高(圖6)。此外，外周血中ALKBH3 mRNA的表達(dá)顯著升高(圖6 b)。小鼠CRC CT26細(xì)胞與BALB/c小鼠建立異種移植，結(jié)果顯示，外周血中5’-tRF-GlyGCC水平(圖6c)和ALKBH3 mRNA表達(dá)(圖6d)顯著。此外，在荷瘤小鼠中5’-tRF-GlyGCC的表達(dá)水平與ALKBH3的表達(dá)顯著正相關(guān)(圖6e)。這些結(jié)果表明，CRC異種移植可促進(jìn)血漿5’-tRF-GlyGCC水平，并伴有體內(nèi)ALKBH3的上調(diào)。

圖6異種移植的CRC腫瘤增加小鼠血漿中5’-tRF-GLYGCC的水平

結(jié)論：

該研究顯示了CRC患者血漿中tDR的分布和豐度，并強(qiáng)調(diào)5’-tRF-GLYGCC是一種有前景的CRC診斷生物標(biāo)志物。此外，通過分析帶有細(xì)胞的腫瘤小鼠的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CRC中5’-tRF-GLYGCC的高水平可能是由于tRNA去甲基化酶ALKBH3的上調(diào)。需要注意的是，tDRs的組成在不同的腫瘤模型中可能是不同的;5’-tRF-GLYGCC作為生物標(biāo)志物的作用及其在其他類型癌癥中的致癌作用還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

Wu Y, Yang X, Jiang G, Zhang H, Ge L, Chen F, Li J, Liu H, Wang H. 5'-tRF-GlyGCC: a tRNA-derived small RNA as a novel biomarker for colorectal cancer diagnosis. Genome Med. 2021, 13(1):20. doi: 10.1186/s13073-021-00833-x.