CircMYH9通過調(diào)節(jié)絲氨酸代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)來驅(qū)動結(jié)直腸癌生長

環(huán)狀RNA（circRNA）在癌癥進(jìn)展和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。絲氨酸/甘氨酸代謝通過促進(jìn)癌細(xì)胞的合成代謝需求和表觀基因組以及調(diào)節(jié)其氧化還原狀態(tài)來支持癌細(xì)胞的生長。然而，circRNA在調(diào)節(jié)絲氨酸/甘氨酸(SG)代謝中的作用尚未得到很好的闡明。今天講一篇關(guān)于circRNA調(diào)節(jié)絲氨酸/甘氨酸代謝的文章，改文章發(fā)表于Molecular Cancer期刊，影響因子27.4。文章題名為：CircMYH9 drives colorectal cancer growth by regulating serine metabolism and redox homeostasis in a p53-dependent manner。

在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中鑒定出circMYH9

為了識別潛在的差異表達(dá)的 circRNA，從 GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選了可能在 CRC和癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA。共檢測到8個下調(diào)的 circRNA和237 個上調(diào)的circRNA。然后，通過微陣列分析進(jìn)一步分析3對CRC和癌旁組織中的circRNA表達(dá)譜，92個circRNA上調(diào)，85個circRNA下調(diào)。數(shù)據(jù)庫中的 237 個上調(diào)circRNA與微陣列中92個上調(diào)circRNA相交，鑒定出9個重疊的 circRNA。在9個circRNA中，hsa_circ_0092283，也稱為 circMYH9，起源于 MYH9 基因，由內(nèi)含子37的頭尾剪接組成。由于circMYH9與其他8個circRNA相比顯著上調(diào)，選擇它進(jìn)行進(jìn)一步研究。qRT-PCR 分析表明 circMYH9可以通過cDNA中的不同引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且在基因組 DNA（gDNA）組中沒有觀察到其他產(chǎn)物。此外，circMYH9 對 RNase R具有抗性，而 MYH9 mRNA 可以被RNase R降解。然后，通過 Sanger 測序證實(shí)了circMYH9 的RT-PCR 產(chǎn)物。

CircMYH9 表達(dá)在 CRC 組織中上調(diào)并預(yù)測預(yù)后不良

qRT-PCR和FISH檢測CRC組織中的circMYH9表達(dá)水平，顯示CRC組織中的circMYH9表達(dá)高于腫瘤周圍組織。然后，檢查了148例CRC病例中 circMYH9表達(dá)與臨床病理結(jié)果的相關(guān)性。circMYH9 水平與腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和 p53 狀態(tài)顯著相關(guān)。circMYH9低表達(dá)患者的無復(fù)發(fā)生存率（RFS）高于高表達(dá)患者，風(fēng)險(xiǎn)比為 0.593。此外，circMYH9高表達(dá)患者的總生存率（OS）顯著低于circMYH9低表達(dá)患者，風(fēng)險(xiǎn)比為 0.547。

CircMYH9促進(jìn)CRC細(xì)胞中的細(xì)胞生長

首先檢查了其在正常腸上皮細(xì)胞系FHC和CRC細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與 FHC細(xì)胞相比，circMYH9在CRC 細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。CCK-8和集落形成測定表明，circMYH9敲低導(dǎo)致HCT116和HCT8細(xì)胞中腫瘤生長的顯著抑制。circMYH9過表達(dá)增加了LoVo細(xì)胞的生長。有趣的是，與上述 p53 野生型 (wt) CRC細(xì)胞系相比，circMYH9 敲低僅略微改變了p53突變的DLD1和HT-29細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分布分析表明，circMYH9敲低導(dǎo)致細(xì)胞周期在G0/G1期停滯，S期和G2/M期細(xì)胞百分比相應(yīng)降低。circMYH9敲低后，細(xì)胞周期蛋白（CDK1、Cyclin D1、CDK6、Cyclin E2）顯著減少，而在CRC細(xì)胞中circMYH9過表達(dá)后，細(xì)胞周期得到促進(jìn)，細(xì)胞周期蛋白增加。由于 HCT116 和 LoVo 細(xì)胞系在 p53 wt CRC 細(xì)胞系中分別相對較高和較低，我們選擇它們進(jìn)行進(jìn)一步研究。

接下來檢查了circMYH9對體內(nèi)CRC腫瘤生長的影響。將circMYH9 shRNA或shCtrl對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞和circMYH9質(zhì)?；蜉d體對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，注射21天后測量腫瘤體積，處死后測量腫瘤重量。與 shCtrl 對照細(xì)胞相比，CircMYH9敲除顯著抑制了腫瘤體積和重量，相比之下，與載體對照細(xì)胞相比，CircMYH9 過表達(dá)表現(xiàn)出增加的腫瘤體積和重量。IHC 分析顯示，由 circMYH9 shRNA 轉(zhuǎn)染的 HCT116 細(xì)胞形成的腫瘤表現(xiàn)出較弱的 Ki67 染色和由過度表達(dá) circMYH9 的 LoVo 細(xì)胞形成的細(xì)胞表現(xiàn)出比源自載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤更強(qiáng)的 Ki67 染色。

CircMYH9通過p53介導(dǎo)的PHGDH上調(diào)促進(jìn)SG代謝

為了深入了解 circMYH9 促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，在對照和敲除 circMYH9的HCT116細(xì)胞中進(jìn)行了RNA-seq，并鑒定了差異表達(dá)的基因。CircMYH9 缺失導(dǎo)致 893 個基因的上調(diào)和 1650 個基因的下調(diào)。然后，使用基因本體（GO）分析和GSEA分析進(jìn)行功能富集分析。前20個GO術(shù)語顯示包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝和p53信號通路。GSEA結(jié)果顯示差異表達(dá)的基因集與SG代謝和p53通路顯著相關(guān)。沉默或過表達(dá)circMYH9，發(fā)現(xiàn)它正調(diào)節(jié)SG生物合成途徑基因（PHGDH、PSAT1、PSPH和SHMT2）的表達(dá)。circMYH9 的沉默或過表達(dá)幾乎不會改變中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SLC1A4 的水平，表明 circMYH9 不能影響SG的攝取。在培養(yǎng)的最后一個小時(shí)，將表達(dá)對照或 circMYH9-shRNA 的 HCT116 細(xì)胞和表達(dá)載體或 circMYH9 質(zhì)粒的 LoVo 細(xì)胞與均勻標(biāo)記的 [U-13C] 葡萄糖一起溫育，并通過液相色譜-質(zhì)譜法檢測。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，shRNA 轉(zhuǎn)染的 HCT116 細(xì)胞中的SG顯著降低，而過表達(dá)circMYH9的 LoVo 細(xì)胞中的 SG 相對于載體細(xì)胞顯著增加。

為了驗(yàn)證circMYH9 是否通過 p53 途徑調(diào)節(jié)SG的合成。qRT-PCR和WB 證明了circMYH9 對p53的負(fù)調(diào)節(jié)。Nutlin-3可激活 p53。Nutlin-3處理過表達(dá) circMYH9的 LoVo 細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了p53和MDM2的下調(diào)，并抑制了SG生物合成途徑基因表達(dá)和細(xì)胞增殖。而circMYH9耗盡的HCT116細(xì)胞中的p53沉默則顯示出相反的效果。還在過度表達(dá) circMYH9 的 LoVo 細(xì)胞中用 shRNA 敲低了 PHGDH。PHGDH 抑制顯示出與 Nutlin-3 處理類似的效果，但不影響 p53 表達(dá)。此外，與對照細(xì)胞相比，具有 circMYH9 敲除的體內(nèi)異種移植物的 IHC 顯示出更高的 p53 表達(dá)和更低的 PHGDH 和 PSPH 表達(dá)。相比之下，circMYH9 過表達(dá)異種移植物的 IHC 顯示 p53 的表達(dá)較低，而 PHGDH 和 PSPH 的表達(dá)高于載體細(xì)胞的表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)了 circMYH9 在 p53 通路和從頭 SG 代謝的調(diào)節(jié)中的主要作用。

CircMYH9 通過 hnRNPA2B1 調(diào)節(jié) p53 前體 mRNA 的穩(wěn)定性

為了解釋 circMYH9 調(diào)節(jié)p53表達(dá)的機(jī)制，進(jìn)行了qRT-PCR和FISH以確定circMYH9在HCT116和LoVo 細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置。結(jié)果表明，circMYH9主要定位于細(xì)胞核中。由于circMYH9敲低不影響p53啟動子活性。有趣的是，在用放線菌素D阻斷新的RNA合成后，發(fā)現(xiàn)沉默 circMYH9 并沒有在 12 小時(shí)內(nèi)改變p53 mRNA 的穩(wěn)定性，但在24小時(shí)內(nèi)顯著增強(qiáng)了p53 mRNA的穩(wěn)定性，表明 circMYH9可能間接抑制p53的mRNA降解。事實(shí)上，circMYH9 siRNA處理后p53前體mRNA表達(dá)增加，circMYH9質(zhì)粒處理后p53前體mRNA表達(dá)降低。結(jié)果表明，circMYH9 的缺失可能導(dǎo)致 p53 前體 mRNA 的增加，進(jìn)而影響 p53 的 mRNA 表達(dá)。

通過circMYH9驗(yàn)證了某些蛋白質(zhì)是否參與調(diào)節(jié)p53前mRNA的穩(wěn)定性。ChIP結(jié)合MS用于鑒定circMYH9的結(jié)合蛋白，在此過程中鑒定了42種蛋白質(zhì)，包括 hnRNPA2B1。為了驗(yàn)證MS結(jié)果，進(jìn)行了RIP測定并觀察到circMYH9在由hnRNPA2B1抗體沉淀的復(fù)合物中的富集。hnRNPA2B1和circMYH9之間的相互作用被非生物素化的 circMYH9 以劑量依賴性方式競爭性抑制。免疫熒光共定位分析顯示 circMYH9 和 hnRNPB2A1 共定位在 CRC 細(xì)胞的細(xì)胞核中、皮爾遜相關(guān)分析（Rx）和相關(guān)系數(shù)分析（R）顯示顯示高度相關(guān)。

為了檢查hnRNPA2B1和p53前體mRNA的關(guān)聯(lián)，進(jìn)行使用抗 hnRNPA2B1的 RIP測定，證明 hnRNPA2B1與p53前體mRNA相互作用。使用生物素化的反義 DNA 探針提取了p53前體mRNA。hnRNPA2B1被共沉淀。hnRNPA2B1 敲低導(dǎo)致 p53 的前體 mRNA 和蛋白質(zhì)水平降低。這些結(jié)果表明 hnRNPA2B1 可能對p53前體 mRNA 發(fā)揮穩(wěn)定作用。qPCR結(jié)果顯示hnRNPA2B1敲低可以消circMYH9缺失對p53 pre-mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用，而 hnRNPA2B1 過表達(dá)可以挽救由circMYH9過表達(dá)誘導(dǎo)的p53前體 mRNA的下調(diào)表達(dá)。circMYH9 敲低增加了hnRNPA2B1和p53前體mRNA之間的結(jié)合，而增加的 circMYH9 表達(dá)減弱了 hnRNPA2B1 與p53前體mRNA的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)表明circMYH9通過阻止hnRNPA2B1與p53前體 mRNA 結(jié)合來抑制p53前體mRNA 的穩(wěn)定性。

p53 3' 非翻譯區(qū) (UTR) 介導(dǎo)的 hnRNPA2B1 對前 mRNA 穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)

為了進(jìn)一步確定 p53 的哪個區(qū)域參與穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，在 HCT116 細(xì)胞中進(jìn)行了 MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)一個顯著的m6A峰分布在 p53 mRNA 的 3'UTR。構(gòu)建了一個帶有 Flag 標(biāo)簽的表達(dá)載體，包括帶有 3'UTR (p53 CDS-3'UTR) 或單獨(dú) CDS (p53 CDS)的p53編碼序列，以及用 hnRNPA2B1 siRNA 共轉(zhuǎn)染的 HCT116 細(xì)胞。結(jié)果表明，hnRNPA2B1 敲低顯著降低了p53 CDS-3'UTR轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞中 p53 的表達(dá)，而不是單獨(dú)的 p53 CDS。這表明 3'UTR 對于 hnRNPA2B1 介導(dǎo)的p53調(diào)節(jié)是必不可少的。

結(jié)果顯示，敲低Mettl3降低了HCT116細(xì)胞中p53前體mRNA水平，而 Mettl3 過表達(dá)增加了p53前體mRNA水平而不影響hnRNPA2B1的蛋白質(zhì)水平。使用針對 p53 3'UTR 和CDS區(qū)域的特異性引物進(jìn)行MeRIP-qPCR以檢測 m6A水平，結(jié)果顯示沉默 Mettl3 導(dǎo)致3' UTR峰m6A甲基化水平降低，而過表達(dá) Mettl3 具有相反的效果。接下來，RIP分析證實(shí)了hnRNPA2B1和p53前體 mRNA 之間的相互作用通過消耗Mettl3被抑制或通過過度表達(dá)Mettl3 增強(qiáng)。

p53 3'UTR 熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)hnRNPA2B1敲低降低了含有 p53 3'UTR的熒光素酶構(gòu)建體的活性，而Mettl3過表達(dá)增加了由 hnRNPA2B1 敲低誘導(dǎo)的熒光素酶活性降低。建立了 p53 3'UTR mut 熒光素酶測定。發(fā)現(xiàn)p53 3'UTR mut的螢光素酶活性對hnRNPA2B1敲低或Mettl3過表達(dá)沒有反應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，p53前體mRNA的表達(dá)受hnRNPA2B1與p53 3'UTR上m6A位點(diǎn)的結(jié)合控制。

CircMYH9在氨基酸剝奪下被ROS-HIF1α通路激活

癌細(xì)胞可能會暫時(shí)或永久地進(jìn)入非必需的營養(yǎng)缺陷狀態(tài)，檢測了氨基酸缺乏是否與CR細(xì)胞中的circMYH9過表達(dá)有關(guān)。我們在缺乏SG或缺乏谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CRC細(xì)胞，并且 circMYH9 響應(yīng)于SG或Glu剝奪而上調(diào)。缺乏 Glu 或 SG 會導(dǎo)致 ROS 水平升高，從而導(dǎo)致 HIF1α增加。使用ROS清除劑 NAC來處理缺乏SG或Glu的細(xì)胞。正如預(yù)期的那樣，NAC在不含SG或不含 Glu的培養(yǎng)基中逆轉(zhuǎn)了HIF1α和circMYH9的升高。HIF1α敲除消除了HCT116 和LoVo細(xì)胞中Glu或SG剝奪誘導(dǎo)的circMYH9表達(dá)。表明SG或Glu剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS積累增加了HIF1α水平，從而促進(jìn)了circMYH9的表達(dá)。

為了探索 HIF1α促進(jìn)circMYH9表達(dá)的分子機(jī)制，測量了 MYH9 前體 mRNA 的表達(dá)。SG或Glu饑餓增加了MYH9的前體mRNA 水平，HIF1α敲低降低了缺乏SG或Glu的CRC細(xì)胞中的MYH9前體 mRNA 水平。這些結(jié)果表明HIF1α在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn) MYH9 前體 mRNA，這進(jìn)一步增加了circMYH9。使用 JASPAR 搜索了MYH9啟動子中的HIF1α結(jié)合位點(diǎn)和基序。確定了兩個最可能的HIF1α結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-qPCR 證明 HIF1α與HCT116細(xì)胞中MYH9 啟動子的兩個HBS位點(diǎn)結(jié)合。為了證實(shí)HIF1α通過HBS促進(jìn)MYH9表達(dá)，構(gòu)建了包含全長MYH9啟動子區(qū)域和HBS缺失的circMYH9啟動子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因。HBS1或HBS2的缺失部分消除了HIF1α敲低或過表達(dá)對MYH9 熒光素酶報(bào)告基因活性的抑制或促進(jìn)，而HBS1和HBS2的缺失則完全消除了 HIF1α shRNA 或質(zhì)粒對MYH9熒光素酶報(bào)告基因活性的影響。這些數(shù)據(jù)表明，HBS區(qū)域?qū)τ?/span>SG或Glu剝奪下的HIF1α依賴性circMYH9轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。

CircMYH9 促進(jìn) p53 野生型小鼠的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生

為了確定 circMYH9 在體內(nèi) CRC 發(fā)病機(jī)制中的因果作用，通過將 p53 fl/fl小鼠與Villin-Cre小鼠雜交，產(chǎn)生了結(jié)腸特異性、條件性 p53 KO小鼠。p53 WT小鼠和 p53 KO小鼠用氧化偶氮甲烷 (AOM) 和葡聚糖硫酸鈉 (DSS) 處理59 天以誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生。在AOM注射前一周，使用AAV9作為載體在小鼠結(jié)腸中特異性過表達(dá)circMYH9。AAV-circMYH9 的轉(zhuǎn)染效率通過qPCR驗(yàn)證。與p53WT小鼠相比，p53KO小鼠的腫瘤數(shù)量、發(fā)病率和大小更多，與AAV-ctrl治療的p53WT小鼠相比，p53WT小鼠中circMYH9的過度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤數(shù)量、發(fā)病率和大小增加。帶有針對 circMYH9 的探針 FISH證實(shí)circMYH9仍然在p53 wt + AAV 小鼠的腫瘤組織中表達(dá)。IHC 檢查顯示，與 ctrl-AAV小鼠相比，具有 circMYH9過表達(dá)的腫瘤顯示出p53的表達(dá)受到抑制，而PHGDH和PSPH的表達(dá)增加?？傊@些結(jié)果表明 circMYH9 可以通過抑制 p53 和促進(jìn)小鼠 SG 代謝來驅(qū)動化學(xué)誘導(dǎo)的致癌作用。

該研究首次證明內(nèi)含子衍生的circMYH9通過調(diào)節(jié)SG代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)促進(jìn)CRC的生長。還確定p53作為circMYH9的靶標(biāo)，并表明circMYH9可以通過募集m6A閱讀器hnRNPA2B1降解 p53前體 mRNA來抑制 p53，進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄抑制 PHGDH 表達(dá)。此外，在 SG或Glu饑餓下鑒定了擴(kuò)增circMYH9的 ROS/HIF1α途徑。工作突出了CRC中circMYH9的新機(jī)制，為監(jiān)測和治療CRC 提供了寶貴的資源。