環(huán)狀RNA circRNF13通過SUMO2抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移

鼻咽癌(鼻咽癌)是鼻咽部上皮性起源的惡性腫瘤，在中國南方和東南亞的發(fā)病率高達(dá)千分之二。然而，迄今為止，涉及鼻咽癌的發(fā)展，特別是轉(zhuǎn)移過程的分子機(jī)制仍不清楚。因此，需要進(jìn)一步了解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，以制定更有效的治療策略。環(huán)狀RNA (Circular RNAs, circRNAs)在人類細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在許多生命過程中具有重要作用，參與包括惡性腫瘤在內(nèi)的許多人類疾病的發(fā)生。雖然已經(jīng)鑒定出了許多環(huán)狀RNA，但絕大多數(shù)環(huán)狀RNA的功能仍不清楚，尤其是在NPC中。因此有作者報(bào)道相關(guān)內(nèi)容，2021年發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：27.401。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CircRNF13在鼻咽癌臨床組織中低表達(dá)

為了獲得環(huán)狀RNA在NPC中的表達(dá)譜，作者對NPC細(xì)胞系5-8F(accession number: PRJNA391554)的下一代mRNA測序(RNAseq)數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新分析。在這些環(huán)狀RNA中，根據(jù)環(huán)狀區(qū)域的不同，分為五種類型:外顯子衍生環(huán)狀RNA、內(nèi)含子衍生環(huán)狀RNA、反義鏈環(huán)狀RNA、義鏈環(huán)狀RNA重疊區(qū)和基因間環(huán)狀RNA(圖1A)。其中一種新的潛在環(huán)狀RNA, circRNF13，在NPC組織中高豐度表達(dá)，但circRNF13在NPE組織中的表達(dá)高于NPC組織(圖1B)。基于circRNF13剪接位點(diǎn)，作者認(rèn)為circRNF13是由RNF13基因（NM_183381.2）的外顯子2-8環(huán)狀剪接形成的染色體 3q25.1，全長716 bp(圖1C)。核質(zhì)分離檢測和RNA熒光原位雜交檢測顯示，circRNF13分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，且更局限于細(xì)胞核。而RNase R(圖1D-E)處理顯示circRNF13在NPC細(xì)胞中比RNF13 mRNA更穩(wěn)定(圖1F)。這些數(shù)據(jù)提示，circRNF13可能影響鼻咽癌的發(fā)育。

圖1 CircRNF13在鼻咽癌中低表達(dá)

2.CircRNF13抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

為了探索circRNF13在NPC中的功能，構(gòu)建了circRNF13過表達(dá)載體，并基于circRNF13的剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)了circRNF13-siRNA。MTT和菌落形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circRNF13抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，敲低circRNF13促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖(圖2A, B)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，過表達(dá)circRNF13的細(xì)胞在G1期停滯，而抑制circRNF13的細(xì)胞數(shù)量在G2/M期增加(圖2C)。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)circRNF13表達(dá)高時(shí)，鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低，而當(dāng)circRNF13表達(dá)低時(shí)，鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低(圖2D)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circRNF13抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲，而下調(diào)circRNF13則促進(jìn)了侵襲(圖2E)?；谶@些觀察，得出circRNF13抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的結(jié)論。

圖2 CircRNF13抑制NPC的增殖、遷移和侵襲

3. CircRNF13在體內(nèi)抑制鼻咽癌生長和轉(zhuǎn)移

接下來，作者研究了circRNF13在體內(nèi)對鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)circRNF13的裸鼠皮下腫瘤較小，而circRNF13敲低組皮下腫瘤較大(圖3A-C)。石蠟包埋、切片和免疫組化染色顯示，circRNF13過表達(dá)組Ki-67表達(dá)明顯低于circRNF13敲低組(圖3D)。尾靜脈肺轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果顯示，circRNF13過表達(dá)組中肺結(jié)節(jié)數(shù)量明顯低于對照組，而circRNF13敲低組肺結(jié)節(jié)數(shù)量增加(圖3E-F)。肺結(jié)節(jié)的H&E染色也顯示，circRNF13過表達(dá)組鼻咽癌肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯低于circRNF13敲低組(圖3G)。綜上所述，circRNF13在體外和體內(nèi)均有抑制鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用。

圖3 CircRNF13在體內(nèi)抑制鼻咽癌生長和轉(zhuǎn)移

4. CircRNF13可能通過抑制糖酵解來抑制鼻咽癌的遷移和侵襲

為了研究circRNF13對鼻中癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，作者采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC MS/MS)對轉(zhuǎn)染sicircRNF13或擾亂siRNA的CNE2細(xì)胞進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNF13抑制了鼻咽癌細(xì)胞中的葡萄糖攝取和乳酸生成(圖4A)。海馬實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)circRNF13導(dǎo)致CNE2和HNE2細(xì)胞的糖酵解能力顯著下降，而下調(diào)circRNF13則顯著增加糖酵解能力(圖4B)。Western blotting結(jié)果顯示，在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)circRNF13顯著上調(diào)磷酸化AMPKα，下調(diào)mTOR，進(jìn)一步下調(diào)mTOR下游靶點(diǎn)pS6K和4EBP1的表達(dá)。另一方面，敲低circRNF13則會產(chǎn)生相反的效果(圖4C)。用糖酵解抑制劑2-DG阻斷糖酵解途徑。當(dāng)添加糖酵解抑制劑2-DG時(shí)，抑制circRNF13并沒有下調(diào)磷酸化AMPKα(圖4D)。這一數(shù)據(jù)表明，敲低circRNF13可促進(jìn)鼻鼻癌細(xì)胞的遷移和侵襲，添加2-DG后這種作用減弱(圖4E-F)。這些結(jié)果提示circRNF13可能通過抑制糖酵解來抑制鼻咽癌的遷移和侵襲。

圖4 CircRNF13抑制鼻咽癌細(xì)胞的糖酵解

5.CircRNF13通過促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞糖酵解GLUT1泛素化

為了研究circRNF13調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞糖酵解過程的分子機(jī)制，作者采用RT-PCR和western blotting在HNE2和CNE2細(xì)胞中檢測糖酵解途徑的主要分子GLUT1、LDHA和HK2。數(shù)據(jù)顯示，在circRNF13過表達(dá)時(shí)GLUT1蛋白水平顯著降低，而在circRNF13敲低時(shí)GLUT1蛋白水平顯著升高，而mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變。CircRNF13在mRNA和蛋白水平上對LDHA和HK2的表達(dá)均有較弱的影響(圖5A, B)。這些數(shù)據(jù)表明，circRNF13可能主要通過調(diào)節(jié)GLUT1來調(diào)節(jié)糖酵解。Western blotting顯示，在circRNF13過表達(dá)時(shí)，GLUT1的穩(wěn)定性降低，而在circRNF13敲低時(shí)，GLUT1的穩(wěn)定性增加(圖5C)。通過抗泛素抗體證實(shí)，過表達(dá)circRNF13促進(jìn)GLUT1泛素化，而敲低circRNF13則降低GLUT1的蛋白泛素化水平(圖5D)。這些結(jié)果表明，circRNF13可能通過調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的GLUT1降解來抑制鼻咽癌細(xì)胞的糖酵解。

圖5 CircRNF13通過促進(jìn)GLUT1泛素化抑制鼻咽癌細(xì)胞的糖酵解

6. CircRNF13通過直接結(jié)合SUMO2 mRNA的3’UTR來促進(jìn)SUMO2的穩(wěn)定性

為了確定circRNF13是否與SUMO2相互作用調(diào)節(jié)增殖、遷移和侵襲，作者進(jìn)行了western blotting和RT-PCR，結(jié)果顯示，circRNF13過表達(dá)顯著誘導(dǎo)了SUMO2在RNA和蛋白水平上的表達(dá)。通過敲除circRNF13得到了相反的結(jié)果(圖6A, B)。生物信息學(xué)分析顯示，在circRNF13和SUMO2的3 -UTR之間存在一個(gè)連續(xù)的結(jié)合基元(圖6C)。RNA pull-down、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)以及放線菌素D (2 μg/mL)檢測證明circRNF13通過與SUMO2的3 ’-UTR結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。

圖6 CircRNF13直接結(jié)合并穩(wěn)定SUMO2 mRNA，上調(diào)其表達(dá)

7. CircRNF13通過SUMO2促進(jìn)GLUT1的泛素化

作者通過Co-IP實(shí)驗(yàn)揭示了GLUT1和UBC9之間的相互作用(圖7A,B)。免疫熒光顯示了SUMO2和GLUT1蛋白的共同定位(圖7C)。為了了解SUMO2在鼻咽癌中的分子基礎(chǔ)，在HNE2和CNE2細(xì)胞中檢測了GLUT1在過表達(dá)或敲低circRNF13時(shí)的SUMOylation。Western blotting顯示，過表達(dá)circRNF13促進(jìn)GLUT1的SUMOylation，敲低circRNF13抑制GLUT1的SUMOylation(圖7D)。為了確定SUMO2是否參與了circRNF13調(diào)控的GLUT1的泛素化，緊接著在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)了SUMO2。泛素化實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)SUMO2可加速GLUT1的泛素化(圖7E)。在sicircRNF13和SUMO2過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的HNE2和CNE2細(xì)胞中，敲低circRNF13可減弱SUMO2誘導(dǎo)的GLUT1泛素化水平(圖7F)。這些數(shù)據(jù)表明，circRNF13通過與SUMO2結(jié)合調(diào)控GLUT1泛素化。

圖7 CircRNF13通過SUMO2促進(jìn)GLUT1的泛素化

8. CircRNF13通過SUMO2抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

MTT法檢測circRNF13是否通過SUMO2抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，結(jié)果顯示，過表達(dá)SUMO2挽救了circRNF13敲低介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的改變(圖8A)。傷口愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，SUMO2挽救了circRNF13敲低介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變(圖8B, C)。海馬實(shí)驗(yàn)也顯示，過表達(dá)SUMO2挽救了由circRNF13敲低引起的鼻咽癌細(xì)胞糖解應(yīng)激的改變(圖8D)。小鼠組織中也進(jìn)行了SUMO2和GLUT1的免疫組化，結(jié)果顯示，在circRNF13過表達(dá)組的裸鼠皮下腫瘤切片中，SUMO2低表達(dá)，而GLUT1高表達(dá)(圖8E)。circRNF13 作為腫瘤抑制因子，直接與 SUMO2 的 3’-UTR 結(jié)合并延長 SUMO2 mRNA 的半衰期。 SUMO2 的上調(diào)通過 GLUT1 的 SUMOylation 和泛素化促進(jìn) GLUT1 降解，其通過抑制糖酵解來調(diào)節(jié) AMPK-mTOR 通路，最終導(dǎo)致 NPC 的增殖和轉(zhuǎn)移（圖 8F）。

圖8 CircRNF13通過SUMO2抑制鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移

結(jié)論：

新型 circRNF13 通過 circRNF13-SUMO2-GLUT1 軸在 NPC 的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。 該研究表明circRNF13通過與SUMO2結(jié)合介導(dǎo)NPC糖酵解，為進(jìn)一步闡明NPC的發(fā)病機(jī)制和靶向治療提供了重要的理論基礎(chǔ)。