LncRNA-HGBC通過調節(jié)miR-502-3p/SET/AKT通路促進膽囊癌發(fā)展

LncRNA在很多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，但在膽囊癌（GBC）中，很多新的LncRNA如何對疾病進行調節(jié)需進一步研究。本文中，作者通過芯片篩選出膽囊癌（GBC）患者中膽囊惡性腫瘤與周圍良性組織微陣列中差異表達的LncRNA和mRNA，并闡明其對GBC細胞增殖、遷移、侵襲的作用機制。

本文技術路線如下：

主要結果如下:

1 、鑒定出LncRNA-HGBC，并發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC表達水平與GBC預后相關

為找出膽囊惡性腫瘤與周圍良性組織中差異表達的LncRNA和mRNA，通過芯片技術篩選出一些候選LncRNA，并發(fā)現(xiàn)其中的LncRNA-HGBC(LncRNA Highly expressed in GBC)在GBC腫瘤細胞中表達量顯著高于周圍良性組織，且LncRNA-HGBC高表達的患者總生存率（OS）顯著低于LncRNA-HGBC低表達的患者（Fig 1A and B），揭示了LncRNA-HGBC在膽囊癌腫瘤細胞轉移中起積極作用。隨后，作者通過RACE快速擴增得到LncRNA-HGBC的5′端及3′端序列（Fig 1C），再通過PCR 擴增GBC全長序列，Northern雜交進一步證實在GBC細胞系中LncRNA HGBC的RNA全長約為2 kb（Fig 1D）。為確定LncRNA-HGBC所在位置，作者分離了NOZ細胞的細胞核和細胞質部分，進行了qRT-PCR檢測，初步判斷LncRNA-HGBC主要定位在細胞質中，與原位雜交(FISH)結果一致（Fig 1E）。通過體外翻譯實驗，發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC并未參與任何蛋白質的表達（Fig 1F），表明LncRNA-HGBC是一個不編碼蛋白質的長鏈RNA。

Figure 1 影響GBC進展的LncRNA的鑒定與表達分析

2、LncRNA-HGBC能在體內外促進GBC細胞增殖

為確定LncRNA-HGBC對GBC細胞增殖及對腫瘤發(fā)生的影響，研究中檢測了LncRNA-HGBC在四種GBC細胞系（NOZ、GBC-SD、SGC-996、EH-GB1）中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)NOZ和SGC-996細胞系中LncRNA-HGBC的表達量高于GBC-SD和EH-GB1細胞系（Fig 2A）。在LncRNA-HGBC高表達的NOZ和SGC-996細胞系中通過干擾LncRNA-HGBC（Fig 2B），發(fā)現(xiàn)任意干擾兩個區(qū)域都會使細胞增殖顯著降低（Fig 2C），于此同時，干擾后菌落數(shù)量也顯著減少，兩種細胞系形成菌落的能力降低（Fig 2D）。此外，為了確定LncRNA-HGBC在體內對GBC細胞生長的影響，在小鼠中比較注射敲除了LncRNA HGBC的NOZ細胞和注射未經(jīng)敲除的NOZ細胞時小鼠之間腫瘤差異，結果發(fā)現(xiàn)，前者較后者的腫瘤體積和腫瘤重量降低30%（Fig 2E）。通過免疫組化檢測增殖細胞核抗原（PCNA），觀察細胞增殖情況，也得到了相同的結論，與對照組比較，LncRNA hGBC水平降低會引起細胞增殖水平下降（Fig 2F）。另一方面，在GBC-SD 和 EH-GB1細胞系中，通過建立LncRNA hGBC過表達的發(fā)現(xiàn)過表達細胞系中細胞的增殖速度明顯提高（Fig 2G 、2H、2I），此外，過表達細胞系中腫瘤的體積和重量是對照組的2.5倍（Fig 2J），通過IHC染色發(fā)現(xiàn)過表達細胞系異種移植瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）上調（Fig 2K）。

Figure 2  LncRNA-HGBC促進GBC細胞增殖和腫瘤生長

3、LncRNA -HGBC促進GBC細胞進行上皮細胞-間充質轉化（EMT）和腫瘤轉移

為了判斷LncRNA –HGBC表達水平與淋巴結細胞遷移之間的關系，研究中首先提出了LncRNA –HGBC促進GBC細胞遷移的假設，并進行驗證。通過transwell和基質膠侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)在NOZ 和 SGC-996 細胞系中，敲除LncRNA -HGBC可顯著減少約30-40%的細胞遷移和侵襲（Fig 3A，3B）。反之，在GBC-SD 和 EH-GB1細胞系中細胞，對LncRNA- HGBC進行過表達，發(fā)現(xiàn)在GBC細胞遷移和侵襲能力增加20-50%（Fig 3C，3D）。EMT（上皮細胞-間充質轉化）在很多腫瘤細胞遷移和侵襲中非常重要，為了評估EMT是否參與GBC侵襲，本研究中檢測了兩種EMT特異性標記物，分別是波形蛋白和N-鈣粘蛋白。作者在NOZ 和SGC-996 cells細胞系中，敲除LncRNA –HGBC發(fā)現(xiàn)波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達量降低（Fig 3E），反之，在GBC-SD 和 EH-GB1細胞系中，對LncRNA- HGBC進行過表達，發(fā)現(xiàn)波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達量升高（Fig 3F），說明LncRNA- HGBC可能引起EMT的發(fā)生。為進一步驗證，作者將NOZ細胞注射到小鼠脾臟中建立了裸鼠肝轉移瘤模型，對照組的6只小鼠中有5只（5/6）在移植6周后顯示熒光素酶信號增強，并在肝內發(fā)生轉移，而注射 干擾LncRNA-HGBC后只小鼠中只有3只小鼠出現(xiàn)肝內轉移。在肝臟中，對 LncRNA-HGBC 進行干擾的小鼠中轉移灶較對照組降低10%（Fig 3G，3H)。

Figure 3  LncRNA-HGBC增強GBC細胞的侵襲能力

4、 HuR與LncRNA-HGBC特異結合并維持LncRNA-HGBC穩(wěn)定表達

為探索LncRNA-HGBC與是否與GBC細胞存在潛在蛋白，通過pull-down實驗，發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC在37kd處存在與蛋白質的互作（Fig 4A），進一步通過 Western免疫印跡證實與LncRNA-HGBC結合的蛋白為HuR（Fig 4B），通過RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）驗證LncRNA-HGBC與HuR的互作，與富含HuR結合位點的陽性對照EIF4E mRNA相比，通過RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗證驗了LncRNA HGBC和HuR之間的特異性相互作用（Fig 4C）。為了進一步確定LncRNA HGBC中的哪個特定區(qū)域與HuR結合有關，作者構建了4個不同的LncRNA -HGBC缺失片段（Fig 4D），通過pull-down實驗之后再進行Western免疫印跡確定了LncRNA -HGBC的1759–1906nt區(qū)域與HuR特異結合（Fig 4E）。為了闡明HuR是否影響LncRNA-HGBC在GBC細胞中的穩(wěn)定性，通過兩次HuR敲除實驗均發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC在NOZ細胞系中的表達量降低（Fig 4F）；為進一步探索 LncRNA-HGBC表達量的降低是不是由于 LncRNA-HGBC衰退所致，通過阻斷RNA的轉錄，觀察30h內 LncRNA-HGBC表達量的變化，結果發(fā)現(xiàn)，隨著HuR的逐步消耗，LncRNA-HGBC水平的半衰期從18小時降低到5小時（Fig 4G），這一系列實驗表明HuR與LncRNA HGBC相互作用并維持LncRNA HGBC穩(wěn)定表達。

Figure 4 HuR與LncRNA-HGBC特異結合并有助于維持LncRNA-HGBC穩(wěn)定表達

5、 LncRNA-HGBC作為一種競爭性內源性RNA抑制miR-502-3p表達

前期的研究已經(jīng)證實LncRNA-HGBC定位在細胞質上，作者初步假設LncRNA -HGBC可能作為miRNA海綿影響miRNA的表達，在GBC的進展中發(fā)揮作用。為了找出與LncRNA-miRNA相互作用的miRNA， 作者將LncRNA-HGBC全長序列克隆到pmirGLO雙熒光素酶報告載體中，將6個與腫瘤抑制相關的候選miRNA通過雙熒光素酶實驗進行分析，發(fā)現(xiàn)其中的miR-502-3p和miR-618可抑制LncRNA-HGBC的熒光素酶活性(Fig 5A)，說明LncRNA-HGBC可能與miR-502-3p、miR-618相互作用。作者根據(jù)先前的miRNA微陣列結果發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤組織相比，在GBC組織中miR-502-3p表達量確實下調了。當LncRNA-HGBC中1176 - 1183nt之間的序列被敲除后將不能與miR-502-3p結合，熒光活性將不會再被抑制(Fig 5B)。AGO2蛋白可以在轉錄后調控調節(jié)miRNA豐度，內源性Ago2的減少會降低成熟miRNA的表達和活性。進一步進行免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)AGO2抗體復合物在LncRNA-HGBC和miR-502-3p中特異富集，表明miR-502-3p是一個真正的靶向LncRNA-HGBC的miRNA(Fig 5C)。為進一步確定LncRNA-HGBC是否與miR-502-3p結合，作者通過MS2-RIP找到與LncRNA-HGBC結合的 miRNA，結果再一次證實了miR-502-3p與LncRNA-HGBC特異性結合(Fig 5D)，而且miR-502-3p結合位點的突變也使miR-502-3p與LncRNA-HGBC之間的結合不再成立，也驗證了LncRNA-HGBC和miR-502-3p之間的直接結合。為了進一步闡明LncRNA-HGBC和miR-502-3p之間基因表達的調控關系，評估了不同lncRNA-HGBC表達水平對細胞中的miR-502-3p水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在 NOZ細胞系中，敲低LncRNA-HGBC 會導致miR-502-3p表達量上調了60%(Fig 5E左圖)，在EH-GB1細胞系中，LncRNA-HGBC過表達后miR-502-3p的表達被抑制，表達量下降了50%(Fig 5E右圖)， 但對miR-502-3p進行敲除或過表達時LncRNA-HGBC的表達量沒有變化，說明LncRNA-HGBC作為海綿會抑制miR-502-3p表達，但不能誘導其降解。為了檢測LncRNA HGBC的活性是否取決于其與miR-502-3p的結合，在異位表達野生型LncRNA HGBC和結合突變型HGBC-MUT后進行cck-8和Transwell分析，結果發(fā)現(xiàn)，LncRNA-HGBC（而非HGBC-MT）的表達可顯著促進細胞遷移、侵襲和增殖(Fig 5F-G)，由此可見，LncRNA-HGBC與miR-502-3p能結合，并可作miR-502-3p的海綿抑制其表達。

Figure 5 LncRNA-HGBC作為一種競爭性內源性RNA能直接與miR-502-3p結合

6、LncRNA-HGBC通過競爭性結合miR-502-3p調節(jié)SET的表達

miR-502-3p可以靶向多種蛋白質，并在癌癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要，作者通過芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SET在GBC組織中也上調，那么miR-502-3p是否對SET進行調節(jié)需進一步探索。作者將含有SET 3′UTR的熒光素酶報告載體轉染到293T細胞中，然后在轉染miR-502-3p模擬物時評估熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)miR-502-3p顯著降低了SET報告載體的熒光素酶活性此外，在GBC細胞系中，對miR-502-3p進行過表達或敲除之后，SET隨之變化，說明SET是miR-502-3p的直接靶點。

由于LncRNA-HGBC和SET 3′UTR都與miR-502-3p結合，于是進一步研究LncRNA HGBC是否調節(jié)了GBC細胞中miR-502-3p，并對SET進行抑制。將pmirGLO-SET熒光素酶報告載體與LncRNA-HGBC過表達質粒進行共轉染，過表達miR-502-3p將會抑制SET報告載體的熒光素酶活性，但過表達cRNA-HGBC將會誘導SET報告載體的熒光素酶活性（Fig 6A)。當miR-502-3p和LncRNA-HGBC同時被添加時，熒光活性恢復到對照水平，這就意味著LncRNA- HGBC能夠通過與miR-502-3p結合，進而上調SET。進一步研究SET 如何控制蛋白表達，在內源性LncRNA HGBC 高表達的 NOZ細胞系中進行LncRNA-HGBC干擾和miR-502-3p抑制，結果發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC的敲除抑制了SET的表達，miR-502-3p抑制劑的加入反而促進了SET的表達（Fig 6B，左圖)。然而，在內源性LncRNA HGBC 低表達的EH-GB1細胞系中，過表達LncRNA-HGBC誘導SET表達，此時加入miR-502-3p，SET表達量將會降低至對照水平（6B，右圖)。在NOZ細胞細胞系中，對LncRNA HGBC進行干擾將會抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，而miR-502-3p的加入逆轉了這種局勢（Fig 6CandD) 。

然而，在EHGB1細胞系中，過表達miR-502-3p延緩了細胞的生長、遷移和侵襲(Fig 6C and E)。為檢測LncRNA HGBC是否誘導SET表達是否取決于LncRNA HGBC與miR-502-3p的結合，在GBC-SD和EH-GB1兩個細胞系中，通過過表達LncRNA-HGBC發(fā)現(xiàn)mRNA和蛋白質水平上SET表達上調，LncRNA HGBC的過度表達導致SET表達增加，而LncRNA HGBC的miR-502-3p結合位點突變卻未能誘導SET表達(Fig 6FandG)，通過IHC發(fā)現(xiàn)，腫瘤異種移植模型中在LncRNA-HGBC耗盡之后SET的表達量也隨之降低，過表達LncRNA-HGBC的腫瘤異種移植模型中LncRNA-HGBC表達量顯著增加，說明LncRNA-HGBC和SET之間存在共表達，LncRNA-HGBC通過競爭性結合miR-502-3p調節(jié)SET的表達。
 

Figure 6  LncRNA-HGBC通過競爭性結合miR-502-3p調節(jié)SET的表達

7、AKT是SET的下游效應物、lncRNA與miR-502-3p、SET和p-AKT的關系

接下來對LncRNA-HGBC和SET對影響GBC轉移的分子機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn)對SET進行敲除后GBC細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，已有研究表明SET在很多癌癥中是通過激活AKT提高癌細胞活性，那么LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT是否作為一個完整的信號通路介導GBC發(fā)生和轉移的需要進一步驗證。

作者首先檢測了AKT激酶的活性，在NOZ和SGC-996細胞系中，通過WB實驗發(fā)現(xiàn)了敲除LncRNA -HGBC顯著抑制了AKT的活性（Fig 7A）；在GBC-SD和EH-GB1細胞系中，過表達LncRNA-HGBC能誘導 AKT的磷酸化，起到信號傳導的作用（Fig 7B）。

為確定LncRNA-HGBC對AKT的誘導是否通過調控miR-502-3p實現(xiàn)的，在GSC-SD和EH-GB1細胞系中，作者通過突變LncRNA-HGBC上與 miR-502-3p結合的位點，發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA-HGBC能誘導 AKT的磷酸化，以及N-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達，進行突變的LncRNA-HGBC不能再對蛋白進行誘導（Fig 7C）。在EH-GB1細胞系中，將miR-502-3p導入過表達LncRNA-HGBC中會降低了這些蛋白的表達（Fig 7D）；MK2206作為AKT抑制劑能逆轉LncRNA-HGBC對N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達的影響（Fig 7E），表明LncRNA HGBC需要AKT激活。

 為了進一步分析LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT之間的關聯(lián)，作者在43對GBC組織中進行分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA HGBC與miR-502-3p呈負相關，與SET和HuR mRNA水平呈正相關（Fig 7F），與非腫瘤組織相比，HuR在GBC組織中表達上調，通過IHC分析發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，SET或p-AKT在GBC組織中表達上調（Fig 7G），此外，LncRNA -HGBC表達與SET和p-AKT表達呈正相關(Fig 7H and G)。綜上所述，LncRNA HGBC能通過競爭性結合miR-502-3p發(fā)揮作用，然后激活下游SET和AKT表達，從而加強腫瘤細胞的侵略性。

Figure 7  AKT是SET的下游效應物、lncRNA與miR-502-3p、SET和p-AKT的關系

本文發(fā)現(xiàn)了一個與GBC預后差相關的LncRNA-HGBC，并闡明了LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT通路介導GBC增殖、遷移、侵襲的分子機制。

參考文獻：

Hu Y P , Jin Y P , Wu X S , et al. LncRNA-HGBC stabilized by HuR promotes gallbladder cancer progression by regulating miR-502-3p/SET/AKT axis[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1). DOI：10.1186/s12943-019-1097-9.