LncRNA-HGBC通過(guò)調(diào)節(jié)miR-502-3p/SET/AKT通路促進(jìn)膽囊癌發(fā)展

LncRNA在很多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，但在膽囊癌（GBC）中，很多新的LncRNA如何對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)需進(jìn)一步研究。本文中，作者通過(guò)芯片篩選出膽囊癌（GBC）患者中膽囊惡性腫瘤與周?chē)夹越M織微陣列中差異表達(dá)的LncRNA和mRNA，并闡明其對(duì)GBC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用機(jī)制。

本文技術(shù)路線(xiàn)如下：

主要結(jié)果如下:

1 、鑒定出LncRNA-HGBC，并發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC表達(dá)水平與GBC預(yù)后相關(guān)

為找出膽囊惡性腫瘤與周?chē)夹越M織中差異表達(dá)的LncRNA和mRNA，通過(guò)芯片技術(shù)篩選出一些候選LncRNA，并發(fā)現(xiàn)其中的LncRNA-HGBC(LncRNA Highly expressed in GBC)在GBC腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于周?chē)夹越M織，且LncRNA-HGBC高表達(dá)的患者總生存率（OS）顯著低于LncRNA-HGBC低表達(dá)的患者（Fig 1A and B），揭示了LncRNA-HGBC在膽囊癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起積極作用。隨后，作者通過(guò)RACE快速擴(kuò)增得到LncRNA-HGBC的5′端及3′端序列（Fig 1C），再通過(guò)PCR 擴(kuò)增GBC全長(zhǎng)序列，Northern雜交進(jìn)一步證實(shí)在GBC細(xì)胞系中LncRNA HGBC的RNA全長(zhǎng)約為2 kb（Fig 1D）。為確定LncRNA-HGBC所在位置，作者分離了NOZ細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分，進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)，初步判斷LncRNA-HGBC主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，與原位雜交(FISH)結(jié)果一致（Fig 1E）。通過(guò)體外翻譯實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC并未參與任何蛋白質(zhì)的表達(dá)（Fig 1F），表明LncRNA-HGBC是一個(gè)不編碼蛋白質(zhì)的長(zhǎng)鏈RNA。

Figure 1 影響GBC進(jìn)展的LncRNA的鑒定與表達(dá)分析

2、LncRNA-HGBC能在體內(nèi)外促進(jìn)GBC細(xì)胞增殖

為確定LncRNA-HGBC對(duì)GBC細(xì)胞增殖及對(duì)腫瘤發(fā)生的影響，研究中檢測(cè)了LncRNA-HGBC在四種GBC細(xì)胞系（NOZ、GBC-SD、SGC-996、EH-GB1）中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOZ和SGC-996細(xì)胞系中LncRNA-HGBC的表達(dá)量高于GBC-SD和EH-GB1細(xì)胞系（Fig 2A）。在LncRNA-HGBC高表達(dá)的NOZ和SGC-996細(xì)胞系中通過(guò)干擾LncRNA-HGBC（Fig 2B），發(fā)現(xiàn)任意干擾兩個(gè)區(qū)域都會(huì)使細(xì)胞增殖顯著降低（Fig 2C），于此同時(shí)，干擾后菌落數(shù)量也顯著減少，兩種細(xì)胞系形成菌落的能力降低（Fig 2D）。此外，為了確定LncRNA-HGBC在體內(nèi)對(duì)GBC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，在小鼠中比較注射敲除了LncRNA HGBC的NOZ細(xì)胞和注射未經(jīng)敲除的NOZ細(xì)胞時(shí)小鼠之間腫瘤差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者較后者的腫瘤體積和腫瘤重量降低30%（Fig 2E）。通過(guò)免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），觀(guān)察細(xì)胞增殖情況，也得到了相同的結(jié)論，與對(duì)照組比較，LncRNA hGBC水平降低會(huì)引起細(xì)胞增殖水平下降（Fig 2F）。另一方面，在GBC-SD 和 EH-GB1細(xì)胞系中，通過(guò)建立LncRNA hGBC過(guò)表達(dá)的發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中細(xì)胞的增殖速度明顯提高（Fig 2G 、2H、2I），此外，過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中腫瘤的體積和重量是對(duì)照組的2.5倍（Fig 2J），通過(guò)IHC染色發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞系異種移植瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）上調(diào)（Fig 2K）。

Figure 2  LncRNA-HGBC促進(jìn)GBC細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)

3、LncRNA -HGBC促進(jìn)GBC細(xì)胞進(jìn)行上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和腫瘤轉(zhuǎn)移

為了判斷LncRNA –HGBC表達(dá)水平與淋巴結(jié)細(xì)胞遷移之間的關(guān)系，研究中首先提出了LncRNA –HGBC促進(jìn)GBC細(xì)胞遷移的假設(shè)，并進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)transwell和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在NOZ 和 SGC-996 細(xì)胞系中，敲除LncRNA -HGBC可顯著減少約30-40%的細(xì)胞遷移和侵襲（Fig 3A，3B）。反之，在GBC-SD 和 EH-GB1細(xì)胞系中細(xì)胞，對(duì)LncRNA- HGBC進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在GBC細(xì)胞遷移和侵襲能力增加20-50%（Fig 3C，3D）。EMT（上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）在很多腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中非常重要，為了評(píng)估EMT是否參與GBC侵襲，本研究中檢測(cè)了兩種EMT特異性標(biāo)記物，分別是波形蛋白和N-鈣粘蛋白。作者在NOZ 和SGC-996 cells細(xì)胞系中，敲除LncRNA –HGBC發(fā)現(xiàn)波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)量降低（Fig 3E），反之，在GBC-SD 和 EH-GB1細(xì)胞系中，對(duì)LncRNA- HGBC進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)量升高（Fig 3F），說(shuō)明LncRNA- HGBC可能引起EMT的發(fā)生。為進(jìn)一步驗(yàn)證，作者將NOZ細(xì)胞注射到小鼠脾臟中建立了裸鼠肝轉(zhuǎn)移瘤模型，對(duì)照組的6只小鼠中有5只（5/6）在移植6周后顯示熒光素酶信號(hào)增強(qiáng)，并在肝內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而注射 干擾LncRNA-HGBC后只小鼠中只有3只小鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。在肝臟中，對(duì) LncRNA-HGBC 進(jìn)行干擾的小鼠中轉(zhuǎn)移灶較對(duì)照組降低10%（Fig 3G，3H)。

Figure 3  LncRNA-HGBC增強(qiáng)GBC細(xì)胞的侵襲能力

4、 HuR與LncRNA-HGBC特異結(jié)合并維持LncRNA-HGBC穩(wěn)定表達(dá)

為探索LncRNA-HGBC與是否與GBC細(xì)胞存在潛在蛋白，通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC在37kd處存在與蛋白質(zhì)的互作（Fig 4A），進(jìn)一步通過(guò) Western免疫印跡證實(shí)與LncRNA-HGBC結(jié)合的蛋白為HuR（Fig 4B），通過(guò)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）驗(yàn)證LncRNA-HGBC與HuR的互作，與富含HuR結(jié)合位點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照EIF4E mRNA相比，通過(guò)RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)證驗(yàn)了LncRNA HGBC和HuR之間的特異性相互作用（Fig 4C）。為了進(jìn)一步確定LncRNA HGBC中的哪個(gè)特定區(qū)域與HuR結(jié)合有關(guān)，作者構(gòu)建了4個(gè)不同的LncRNA -HGBC缺失片段（Fig 4D），通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)之后再進(jìn)行Western免疫印跡確定了LncRNA -HGBC的1759–1906nt區(qū)域與HuR特異結(jié)合（Fig 4E）。為了闡明HuR是否影響LncRNA-HGBC在GBC細(xì)胞中的穩(wěn)定性，通過(guò)兩次HuR敲除實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC在NOZ細(xì)胞系中的表達(dá)量降低（Fig 4F）；為進(jìn)一步探索 LncRNA-HGBC表達(dá)量的降低是不是由于 LncRNA-HGBC衰退所致，通過(guò)阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄，觀(guān)察30h內(nèi) LncRNA-HGBC表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著HuR的逐步消耗，LncRNA-HGBC水平的半衰期從18小時(shí)降低到5小時(shí)（Fig 4G），這一系列實(shí)驗(yàn)表明HuR與LncRNA HGBC相互作用并維持LncRNA HGBC穩(wěn)定表達(dá)。

Figure 4 HuR與LncRNA-HGBC特異結(jié)合并有助于維持LncRNA-HGBC穩(wěn)定表達(dá)

5、 LncRNA-HGBC作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA抑制miR-502-3p表達(dá)

前期的研究已經(jīng)證實(shí)LncRNA-HGBC定位在細(xì)胞質(zhì)上，作者初步假設(shè)LncRNA -HGBC可能作為miRNA海綿影響miRNA的表達(dá)，在GBC的進(jìn)展中發(fā)揮作用。為了找出與LncRNA-miRNA相互作用的miRNA， 作者將LncRNA-HGBC全長(zhǎng)序列克隆到pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體中，將6個(gè)與腫瘤抑制相關(guān)的候選miRNA通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中的miR-502-3p和miR-618可抑制LncRNA-HGBC的熒光素酶活性(Fig 5A)，說(shuō)明LncRNA-HGBC可能與miR-502-3p、miR-618相互作用。作者根據(jù)先前的miRNA微陣列結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤組織相比，在GBC組織中miR-502-3p表達(dá)量確實(shí)下調(diào)了。當(dāng)LncRNA-HGBC中1176 - 1183nt之間的序列被敲除后將不能與miR-502-3p結(jié)合，熒光活性將不會(huì)再被抑制(Fig 5B)。AGO2蛋白可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控調(diào)節(jié)miRNA豐度，內(nèi)源性Ago2的減少會(huì)降低成熟miRNA的表達(dá)和活性。進(jìn)一步進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AGO2抗體復(fù)合物在LncRNA-HGBC和miR-502-3p中特異富集，表明miR-502-3p是一個(gè)真正的靶向LncRNA-HGBC的miRNA(Fig 5C)。為進(jìn)一步確定LncRNA-HGBC是否與miR-502-3p結(jié)合，作者通過(guò)MS2-RIP找到與LncRNA-HGBC結(jié)合的 miRNA，結(jié)果再一次證實(shí)了miR-502-3p與LncRNA-HGBC特異性結(jié)合(Fig 5D)，而且miR-502-3p結(jié)合位點(diǎn)的突變也使miR-502-3p與LncRNA-HGBC之間的結(jié)合不再成立，也驗(yàn)證了LncRNA-HGBC和miR-502-3p之間的直接結(jié)合。為了進(jìn)一步闡明LncRNA-HGBC和miR-502-3p之間基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系，評(píng)估了不同lncRNA-HGBC表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞中的miR-502-3p水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 NOZ細(xì)胞系中，敲低LncRNA-HGBC 會(huì)導(dǎo)致miR-502-3p表達(dá)量上調(diào)了60%(Fig 5E左圖)，在EH-GB1細(xì)胞系中，LncRNA-HGBC過(guò)表達(dá)后miR-502-3p的表達(dá)被抑制，表達(dá)量下降了50%(Fig 5E右圖)， 但對(duì)miR-502-3p進(jìn)行敲除或過(guò)表達(dá)時(shí)LncRNA-HGBC的表達(dá)量沒(méi)有變化，說(shuō)明LncRNA-HGBC作為海綿會(huì)抑制miR-502-3p表達(dá)，但不能誘導(dǎo)其降解。為了檢測(cè)LncRNA HGBC的活性是否取決于其與miR-502-3p的結(jié)合，在異位表達(dá)野生型LncRNA HGBC和結(jié)合突變型HGBC-MUT后進(jìn)行cck-8和Transwell分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA-HGBC（而非HGBC-MT）的表達(dá)可顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲和增殖(Fig 5F-G)，由此可見(jiàn)，LncRNA-HGBC與miR-502-3p能結(jié)合，并可作miR-502-3p的海綿抑制其表達(dá)。

Figure 5 LncRNA-HGBC作為一種競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA能直接與miR-502-3p結(jié)合

6、LncRNA-HGBC通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-502-3p調(diào)節(jié)SET的表達(dá)

miR-502-3p可以靶向多種蛋白質(zhì)，并在癌癥發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要，作者通過(guò)芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SET在GBC組織中也上調(diào)，那么miR-502-3p是否對(duì)SET進(jìn)行調(diào)節(jié)需進(jìn)一步探索。作者將含有SET 3′UTR的熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，然后在轉(zhuǎn)染miR-502-3p模擬物時(shí)評(píng)估熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)miR-502-3p顯著降低了SET報(bào)告載體的熒光素酶活性此外，在GBC細(xì)胞系中，對(duì)miR-502-3p進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除之后，SET隨之變化，說(shuō)明SET是miR-502-3p的直接靶點(diǎn)。

由于LncRNA-HGBC和SET 3′UTR都與miR-502-3p結(jié)合，于是進(jìn)一步研究LncRNA HGBC是否調(diào)節(jié)了GBC細(xì)胞中miR-502-3p，并對(duì)SET進(jìn)行抑制。將pmirGLO-SET熒光素酶報(bào)告載體與LncRNA-HGBC過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，過(guò)表達(dá)miR-502-3p將會(huì)抑制SET報(bào)告載體的熒光素酶活性，但過(guò)表達(dá)cRNA-HGBC將會(huì)誘導(dǎo)SET報(bào)告載體的熒光素酶活性（Fig 6A)。當(dāng)miR-502-3p和LncRNA-HGBC同時(shí)被添加時(shí)，熒光活性恢復(fù)到對(duì)照水平，這就意味著LncRNA- HGBC能夠通過(guò)與miR-502-3p結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)SET。進(jìn)一步研究SET 如何控制蛋白表達(dá)，在內(nèi)源性LncRNA HGBC 高表達(dá)的 NOZ細(xì)胞系中進(jìn)行LncRNA-HGBC干擾和miR-502-3p抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA-HGBC的敲除抑制了SET的表達(dá)，miR-502-3p抑制劑的加入反而促進(jìn)了SET的表達(dá)（Fig 6B，左圖)。然而，在內(nèi)源性LncRNA HGBC 低表達(dá)的EH-GB1細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC誘導(dǎo)SET表達(dá)，此時(shí)加入miR-502-3p，SET表達(dá)量將會(huì)降低至對(duì)照水平（6B，右圖)。在NOZ細(xì)胞細(xì)胞系中，對(duì)LncRNA HGBC進(jìn)行干擾將會(huì)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，而miR-502-3p的加入逆轉(zhuǎn)了這種局勢(shì)（Fig 6CandD) 。

然而，在EHGB1細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)miR-502-3p延緩了細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲(Fig 6C and E)。為檢測(cè)LncRNA HGBC是否誘導(dǎo)SET表達(dá)是否取決于LncRNA HGBC與miR-502-3p的結(jié)合，在GBC-SD和EH-GB1兩個(gè)細(xì)胞系中，通過(guò)過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC發(fā)現(xiàn)mRNA和蛋白質(zhì)水平上SET表達(dá)上調(diào)，LncRNA HGBC的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致SET表達(dá)增加，而LncRNA HGBC的miR-502-3p結(jié)合位點(diǎn)突變卻未能誘導(dǎo)SET表達(dá)(Fig 6FandG)，通過(guò)IHC發(fā)現(xiàn)，腫瘤異種移植模型中在LncRNA-HGBC耗盡之后SET的表達(dá)量也隨之降低，過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC的腫瘤異種移植模型中LncRNA-HGBC表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明LncRNA-HGBC和SET之間存在共表達(dá)，LncRNA-HGBC通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-502-3p調(diào)節(jié)SET的表達(dá)。
 

Figure 6  LncRNA-HGBC通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-502-3p調(diào)節(jié)SET的表達(dá)

7、AKT是SET的下游效應(yīng)物、lncRNA與miR-502-3p、SET和p-AKT的關(guān)系

接下來(lái)對(duì)LncRNA-HGBC和SET對(duì)影響GBC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)SET進(jìn)行敲除后GBC細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯降低，已有研究表明SET在很多癌癥中是通過(guò)激活AKT提高癌細(xì)胞活性，那么LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT是否作為一個(gè)完整的信號(hào)通路介導(dǎo)GBC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者首先檢測(cè)了AKT激酶的活性，在NOZ和SGC-996細(xì)胞系中，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了敲除LncRNA -HGBC顯著抑制了AKT的活性（Fig 7A）；在GBC-SD和EH-GB1細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC能誘導(dǎo) AKT的磷酸化，起到信號(hào)傳導(dǎo)的作用（Fig 7B）。

為確定LncRNA-HGBC對(duì)AKT的誘導(dǎo)是否通過(guò)調(diào)控miR-502-3p實(shí)現(xiàn)的，在GSC-SD和EH-GB1細(xì)胞系中，作者通過(guò)突變LncRNA-HGBC上與 miR-502-3p結(jié)合的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC能誘導(dǎo) AKT的磷酸化，以及N-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達(dá)，進(jìn)行突變的LncRNA-HGBC不能再對(duì)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)（Fig 7C）。在EH-GB1細(xì)胞系中，將miR-502-3p導(dǎo)入過(guò)表達(dá)LncRNA-HGBC中會(huì)降低了這些蛋白的表達(dá)（Fig 7D）；MK2206作為AKT抑制劑能逆轉(zhuǎn)LncRNA-HGBC對(duì)N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的影響（Fig 7E），表明LncRNA HGBC需要AKT激活。

 為了進(jìn)一步分析LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT之間的關(guān)聯(lián)，作者在43對(duì)GBC組織中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA HGBC與miR-502-3p呈負(fù)相關(guān)，與SET和HuR mRNA水平呈正相關(guān)（Fig 7F），與非腫瘤組織相比，HuR在GBC組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)IHC分析發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，SET或p-AKT在GBC組織中表達(dá)上調(diào)（Fig 7G），此外，LncRNA -HGBC表達(dá)與SET和p-AKT表達(dá)呈正相關(guān)(Fig 7H and G)。綜上所述，LncRNA HGBC能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-502-3p發(fā)揮作用，然后激活下游SET和AKT表達(dá)，從而加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵略性。

Figure 7  AKT是SET的下游效應(yīng)物、lncRNA與miR-502-3p、SET和p-AKT的關(guān)系

本文發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與GBC預(yù)后差相關(guān)的LncRNA-HGBC，并闡明了LncRNA-HGBC-miR-502-3p-SET-AKT通路介導(dǎo)GBC增殖、遷移、侵襲的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

Hu Y P , Jin Y P , Wu X S , et al. LncRNA-HGBC stabilized by HuR promotes gallbladder cancer progression by regulating miR-502-3p/SET/AKT axis[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1). DOI：10.1186/s12943-019-1097-9.