膽固醇穩(wěn)態(tài)失調導致鐵死亡抵抗增加腫瘤的致瘤性和轉移

高膽固醇血癥和血脂異常與許多癌癥類型的風險增加和已確診疾病患者的不良預后相關。然而，這種情況發(fā)生的機制是多因素的。證據表明，高膽固醇血癥是絕經后婦女患乳腺癌的獨立危險因素。作者發(fā)現(xiàn)，細胞長期暴露于27-羥基膽固醇(27HC)，一種豐富的循環(huán)膽固醇代謝物，會選擇性使細胞表現(xiàn)出細胞攝取和/或脂質生物合成增加。這些細胞表現(xiàn)出腫瘤發(fā)生和轉移的能力。重要的是，積累的脂質對細胞施加的代謝壓力需要GPX4的持續(xù)表達，這是一種鐵死亡的負調節(jié)劑。作者發(fā)現(xiàn)鐵死亡抵抗是轉移性細胞的一個特征，并進一步證實GPX4敲除減輕了27HC抵抗細胞的腫瘤生成和轉移活性。本文于2021年9月發(fā)表在《Nature Communications》IF:14.919。

技術路線

主要實驗結果

1、羥甾醇27HC通過抑制膽固醇攝取/合成的能力來減少癌細胞的生長

首先評估了27HC對雌激素受體（ER）陽性MCF7細胞在去除外源性類固醇的培養(yǎng)基(炭剝離培養(yǎng)基(CFS))與完全培養(yǎng)基（FBS）中的生長活性。在這里，使用的27HC的濃度范圍是正常個體循環(huán)中的~1 μM至高脂血癥患者體內的2.5–5 μM。結果發(fā)現(xiàn)，在CFS中，雌激素活性的27HC支持了細胞增殖，但是在FBS中，同樣濃度的27HC抑制了細胞增殖（Fig 1a）。類似的，27HC在CFS中促進集落形成，在FBS中抑制集落形成（Fig 1b）。但是這些結果在ER陰性細胞完全相反，其27HC抑制了乳腺癌細胞系4T1, MDAMB436, Py230, MDAMB231, HCC1954的增殖（Fig 1c）。在2D培養(yǎng)體系中，雌激素無反應的Met1細胞對27HC的抗增殖活性具有抵抗作用，但是在3D培養(yǎng)的集落形成實驗中，27HC有效的抑制了4T1，Met1的集落形成（Fig. 1d）。這些結果表明，不同于ER陽性細胞，在ER陰性細胞中27HC抑制細胞增殖，集落形成和體外遷移。

我們認為27HC對觀察到的ER陰性癌細胞生物學的影響可能歸因于它作為膽固醇合成/攝取的負調控因子通過對SREBP和LXR依賴的信號通路的作用。事實上，作者發(fā)現(xiàn)在受檢的腫瘤細胞中，27HC抑制SREBP1c和SREBP2的靶基因的表達，而作為LXR受體激動劑活性也在一些細胞系中觀察到（Fig. 1e）。盡管如此，作者不認為27HC的LXR活性對其癌細胞的作用有顯著貢獻，因為已經證明(a)在探索的細胞中，27HC是LXR相對較弱的部分激動劑，(b) LXR完全激動劑在這些細胞中不復制27HC的抗增殖活性。因此，盡管27HC可以激活LXR并誘導細胞膽固醇外流相關基因的表達，但這種活性不足以抑制癌細胞的增殖。這就表明27HC的主要功能可能是抑制SREBP依賴的脂質/膽固醇攝取和合成。為了支持這一觀點，作者證明了補充膽固醇可以逆轉27HC的抗增殖活性（Fig. 1d），而甲戊酸和其他膽固醇生物合成的上游中間體無法挽救27HC對癌細胞生長或集落形成的抑制作用（Fig. 1d）。以上表明27HC在細胞中的抗增殖活性主要是抑制膽固醇的合成/攝取。

圖1 27HC抑制ER陰性乳腺癌細胞的生長

2、在體內，慢性暴露于27HC可選擇更具致瘤性和轉移性的細胞

目前已建立的聯(lián)系是膽固醇升高和癌癥進展相關，作者認為，雖然這些臨床觀察與27HC抑制細胞增殖的結果不一致，這可能與本研究中通過使細胞/腫瘤發(fā)生膽固醇/ 27HC急性升高而建立的高膽固醇血癥模型有關。為了探索這種可能性，構建27HC抗性版本的4T1、Py230、BPD6、HCC1954、MDAMB436和B16F10細胞，在5μM 27HC持續(xù)存在的2D培養(yǎng)中傳代14個月，直到菌落出現(xiàn)。4T1、Py230和BPD6的27HC敏感和等基因抗性細胞在2D培養(yǎng)下的時間/劑量-響應生長曲線如Fig. 2a所示。盡管27HC的敏感性存在顯著差異，但在不含27HC的情況下，敏感細胞（27HCS）和耐藥細胞（27HCR）的總體增殖能力相似。然而，當作為異種移植物在小鼠體內傳播時，所有這三種細胞模型的27HC抵抗衍生物都顯示出比27HC敏感的衍生物更具有致瘤性(Fig.2b)。尾靜脈注射模型評估敏感和耐藥細胞的肺轉移能力，結果顯示，在三種模型(4T1, Py230和BPD6)中，對27HC的抗性與顯著增加的轉移潛能相關(圖2c)。綜上所述，細胞在適應27HC水平的增加時，獲得了使它們更具致瘤性和轉移性的活性。

圖2慢性暴露于27HC可選擇性增加惡性表型的細胞

3、細胞內脂質積累增加是抗27HC的一個特征，也和致瘤性有因果關系

隨后探究27HC抵抗增加致瘤性和轉移性的生物化學機制。首先探討了27HC下調膽固醇/脂類合成的機制可能在抵抗細胞中被破壞的可能性。然而，基因表達分析顯示，在基礎條件下，編碼這些過程的關鍵調控步驟的mRNA變化不大，而且在敏感和耐藥細胞中，27HC仍然是它們表達的有效抑制劑（Fig. 3a）。這表明在27HC抵抗細胞中，27HC對SREBP活性的負反饋保持完整。然而，使用BODIPY染色評估脂質含量時，發(fā)現(xiàn)所有27HCR細胞都積累了大量的中性脂質，以細胞質脂滴(LDs)的形式儲存（Fig. 3b）。提示為了抵消27HC對膽固醇和脂類合成的抑制作用，27HCR細胞可能增加了它們攝取中性脂質的能力。為了直接解決這一問題，并確認積累的脂質的身份，對HCC1954細胞的27HCR和27HCS衍生物進行了全面的脂質組學分析，發(fā)現(xiàn)細胞對27HC抗增殖作用的一個特點是脂質攝取增加和脂質生物合成的減少。

雖然脂質攝取增加和/或生物合成之間的關聯(lián)被確定為27HC耐藥的標志，但這種活性在多大程度上與耐藥相關和/或是否有助于癌細胞生物學的變化尚不清楚。為了解決這一問題，作者反復研究了27HCS和27HCR的4T1、Py230、HCC1954、B16F10和BPD6細胞在富脂和脫脂培養(yǎng)基中對27HC的敏感性/耐藥性。如Fig. 3c所示，除BPD6細胞外，27HC的抗增殖活性僅在脂質充足的條件下表現(xiàn)出來。鑒于與BPD6-27HCS相比，BPD6-27HCR中涉及膽固醇和脂肪酸生物合成的基因表達上調(見Fig.S4a和Fig.S2)，這些細胞中積累的一些脂質可能是內源性產生的。研究還強調了脂質積累在耐藥細胞中的重要性，研究表明脂質消耗逆轉了27HCR細胞體外遷移能力的增加（Fig. 3d）。綜上所述，這些數(shù)據表明，在獲得對27HC的抗性時，27HCR細胞增加了它們的脂質攝取，這一活動可能有助于增加它們的惡性表型。

圖3脂質攝取增加是細胞抵抗27HC抗增殖作用的一個特征

4、27HC抗性細胞可防止細胞鐵死亡

異常的脂質代謝涉及到癌癥細胞病理學的多個方面。但是本研究中觀察到的27HC細胞中脂質積累也被認為是給細胞帶來了代謝壓力，而27HC細胞克服了這種脂質過氧化的積累。近來，細胞可以忍受GPX4依賴抗氧化途徑和脂質氧化酶下調產生的脂質依賴壓力。因此，作者推測在進化到27HC耐藥狀態(tài)的過程中，癌細胞可能會增加誘導鐵死亡的閾值。作為這些研究的起點，作者評估了GPX4在幾種細胞系(B16F10、Py230、HCC1954和MDAMB436)中的表達。WB表明，GPX4在所有細胞中均有表達，且在27HC濃度增加的情況下，GPX4表達下調（Fig. 4a）。這是一個重要的發(fā)現(xiàn)，盡管并非完全出乎意料，因為GPX4合成所需的特殊selenocysteine-tRNA的成熟需要焦磷酸異戊酯（來自甲戊酸途徑）。事實上，在細胞補充外源性甲戊酸后，27HC依賴性下調GPX4的表達會顯著減弱（Fig. 4b）。此外，在Py230、HCC1954和MDAMB436細胞的27HCR衍生物中，觀察到與脂質過氧化增加相關的基因(Acsl4、Lpcat3和Pebp1)的表達下調（Fig. 4c）。綜上，調控機制的破壞導致GPX4的下調，以及通過調節(jié)與脂質過氧化相關基因的表達來降低GPX4通路的脅迫，是27HCR細胞的一個特征。無論其機制如何，作者推斷，如果GPX4的穩(wěn)定表達和/或活性與27HC抗性表型(ferroptosis)有因果關系，那么27HCR細胞應該對GPX4途徑的抑制劑有更強的抗性。如Fig.4d所示，B16F10、Py230、MDAMB436、HCC1954和4T1細胞對GPX4的直接抑制劑(RSL3和ML210)和xc轉運體(erastin)的抗性明顯增強。這些藥物對所有27HCS細胞活力的影響被ferroptosis抑制劑ferrostatin逆轉，證實鐵死亡確實是這些藥物靶向的目標。進一步研究表明GPX4抑制劑(RSL3和ML210)導致27HCS細胞中脂質過氧化物大量增加，但在27HCR細胞系中沒有觀察到(圖4e)。結論是，在適應脂質誘導的代謝應激中，細胞可以通過穩(wěn)定GPX4的表達，增加GPX4依賴的抗氧化系統(tǒng)的活性，或減少脂質過氧化物的產生來避免鐵死亡，進而產生對27HC的抗性。

圖4 27HCR細胞對鐵死亡有抗性

5、GPX4活性預防鐵死亡促進轉移

作者推測細胞對鐵死亡的抗性可能使細胞能夠抗住在轉移過程中面臨的代謝和環(huán)境壓力。如Fig. 5a所示，注射Py230-27HCS細胞的小鼠發(fā)生micrometastasis，而注射Py230-27HCR細胞的小鼠發(fā)生macrometastasis；但是無論是從micrometastasis還是從macrometastasis處分離出的轉移病灶表現(xiàn)出相似的對鐵死亡誘導劑（RSL3和ML210）相同的抗性（Fig. 5a，右）。因此，27HCR細胞轉移表型的增加可能是促進27HC抗性的適應性事件的結果，而不是與羥甾醇治療相關的基因表達/生化活性的特定變化。

此外，GPX4的敲除顯著降低了B16F10細胞27HCS和27HCR衍生物的轉移，盡管后者的轉移程度較低（Fig. 5b）。同樣，通過直接計數(shù)轉移結節(jié)證明，在Py230細胞的27HCR衍生物中觀察到的轉移表型在GPX4敲低后完全消除（Fig. 5c）。這些數(shù)據證實了GPX4在轉移過程中預防鐵死亡的重要作用。

圖5 GPX4抑制可使27HCR細胞對ferroptosis敏感并降低其轉移能力

總之，在處理與脂質代謝失調相關的壓力時，細胞如何上調GPX4軸的活性和/或減少對GPX4的依賴以適應這種壓力，這有增加細胞轉移能力的附帶責任。急性27HC （Fig.5，左）處理通過干擾SREBPs和LXR信號傳導擾亂脂質代謝，從而導致細胞生長和遷移的抑制。癌細胞可以適應由慢性27HC處理帶來的代謝壓力（Fig.5，右）。存活的細胞(27HC抵抗細胞)增加脂質攝取，并通過上調抵抗脂質氧化應激過程的活性來調節(jié)與此活動相關的代謝應激，一種增強腫瘤生長和轉移能力的活動。

圖6 腫瘤細胞對27HC治療的反應的機制模型

參考文獻：

Liu Wen., Chakraborty Binita., Safi Rachid., Kazmin Dmitri., Chang Ching-Yi., McDonnell Donald P.(2021). Dysregulated cholesterol homeostasis results in resistance to ferroptosis increasing tumorigenicity and metastasis in cancer. Nat Commun, 12(1), 5103. doi:10.1038/s41467-021-25354-4