LncRNA PD-L1剪切亞型通過提高c-Myc活性促進(jìn)肺癌發(fā)展

腫瘤細(xì)胞通過多種機制逃避機體免疫系統(tǒng)識別和攻擊，從而得以在體內(nèi)生存和增殖的現(xiàn)象。目前常通過對程序性死亡細(xì)胞(PD-1)的抑制，來阻止免疫反應(yīng)的終止，PD-1抑制劑常被認(rèn)為是治療癌癥的有效手段。但PD-L1抑制劑的功效在許多實體瘤癌癥患者中的效果是有限的，研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌（LUAD）患者體內(nèi)，除了mRNA PD-L1，LncRNA PD-L1可以通過可變剪切實現(xiàn)免疫檢查點抑制，IFNγ能促進(jìn)mRna PD-L1和ncRNA PD-L1的表達(dá)。PD-L1-Lnc一旦生成，通過直接結(jié)合c-Myc并激活c-Myc轉(zhuǎn)錄活性，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)LUAD患者腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，基于此，本文研究新的LncRNA PD-L1在肺腺癌發(fā)展過程中的分子機制。這篇文章于2021年發(fā)表在《Genome Biology》雜志上，IF= 10.806。

本文技術(shù)路線如下：

主要結(jié)果如下:

1肺腺癌(LUAD)細(xì)胞及其細(xì)胞系中均可通過選擇性剪接產(chǎn)生mRNA PD-L1亞型LncRNA PD-L1

為探索LUAD不同階段PD-L1蛋白的表達(dá)量異，對PD-L1蛋白陽性和陰性樣品均進(jìn)行了mRNA PD-L1表達(dá)的檢測，結(jié)果在198 bp 和 92 bp 處都擴增出了條帶(Fig 1A，左圖)。Sanger測序結(jié)果顯示，198 bp條帶與PD-L1 mRNA序列相匹配(Fig 1A，右圖)，而92bp處條帶為非編碼亞型PD-L1（PD-L1-Lnc）(Fig 1A， 右下圖)。為進(jìn)一步證實，設(shè)計了探針對缺失片段進(jìn)行檢測(Fig 1B， 上圖)，在878 bp 和705 bp處檢測出兩條條帶，878bp條帶與PD-L1 mRNA序列相匹配，而705 bp的條帶顯示與PD-L1 mRNA相比，第4個外顯子中存在106 nt的序列缺失，第5個和第6個外顯子之間存在67 nt的缺失(Fig 1B，右下)。通過BASESCOPE顯色實驗發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中mRNA PD-L1（藍(lán)點）和LncRNA PD-L1（紅點）存在明顯的共表達(dá)（Fig 1C）；接下來，作者設(shè)計了PD-L1 mRNA和PD-L1-Lnc的特異性探針，對這些RNA片段進(jìn)行定量(Fig 1D，上圖)，通過PCR探針擴增并進(jìn)行qRT-PCR檢測，檢測到PD-L1蛋白陽性和陰性樣品中在PD-L1 mRNA和PD-L1-ln數(shù)量一致(Fig 1D，中圖，右圖)。

Figure 1 PD-L1通過可變剪接產(chǎn)生PD-L1-Lnc

接下來，通過WB和流式細(xì)胞儀檢測肺癌不同的細(xì)胞系中（A549， PC9， H1975， H1650， H1299）中PD-L1-Lnc和 PD-L1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1在不同的細(xì)胞系中表達(dá)存在差異(Fig 2A、B)，且通過瓊脂糖凝膠電泳、BASESCOPE、RT-PCR均能檢出PD-L1 mRNA和PD-L1-Lnc(Fig. 2C-E)。

Figure 2 PD-L1-Lnc在不同LUAD細(xì)胞系中的表達(dá)

2  IFNγ也會促進(jìn)PD-L1- Lnc的表達(dá)

已有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞分泌的IFN-γ（干擾素-γ）能上調(diào)PD-L1 mRNA和蛋白的表達(dá)，那么癌癥細(xì)胞是否能連接T細(xì)胞表面的PD-1進(jìn)而抑制細(xì)胞免疫有待進(jìn)一步驗證。與PD-L1-mRNA相比，PD-L1-Lnc在638 -744 和832 -899處存在缺失（Fig 3A），進(jìn)一步假設(shè)IFNγ會增強PD-L1- Lnc的轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步驗證，在沒有IFN-γ的前提下對五個細(xì)胞系中的PD-L1蛋白含量、PD-L1 mRNA， 以及 PD-L1-Lnc水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFNγ確實能極大地促進(jìn)PD-L1蛋白的表達(dá)。5個肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行IFNγ治療也明顯提高了PD-L1 mRNA的表達(dá)水平(Fig 3B)，為了進(jìn)一步研究PD-L1-Lnc在肺癌細(xì)胞中的分布，從A549細(xì)胞系中分離純化了PD-L1-Lnc， 分離的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分都表現(xiàn)出高水平的標(biāo)記蛋白，組蛋白H3和GAPDH證實了分離產(chǎn)物中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)富集的富集情況(Fig 3C，左圖)，RT-PCR結(jié)果顯示IFNγ處理上調(diào)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中PD-L1-Lnc和PD-L1 mRNA的表達(dá)(Fig 3c，右圖)。

Fig3 IFNγ能調(diào)節(jié)PD-L1-Lnc的表達(dá)

   本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中，雖然PD-L1-Lnc并不影響PD-L1-mRNA和蛋白的表達(dá)，但依然影響細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。在A549 和PC9細(xì)胞系中，過表達(dá)PD-L1-Lnc與對照相比，細(xì)胞的增殖、侵襲能力、抑制細(xì)胞凋亡能力明顯增強(Fig 4A-C)。接下來，在肺癌異種移植小鼠模型中進(jìn)一步驗證，分別在A549細(xì)胞系中對PD-L1-Lnc進(jìn)行過表達(dá)和干擾，并與陰性對照組進(jìn)行比較，雖然在整個實驗過程中，三組小鼠的體重沒有顯著差異(Fig 5A)，但對腫瘤大小進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，這些肺癌細(xì)胞的生長速度明顯不同(Fig 5B-C)。在A549細(xì)胞系中，過表達(dá)PD-L1-Lnc組的腫瘤大小明顯高于對照組，PD-L1-Lnc shRNA組的腫瘤大小明顯低于腫瘤對照組；腫瘤組織切片Ki67染色顯示，PD-L1-Lnc的表達(dá)情況與細(xì)胞增殖率呈正相關(guān)(Fig 5D)。RT-PCR發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PD-L1-Lnc過表達(dá)和干擾組PD-L1-Lnc表達(dá)水平分別顯著升高和降低，而PD-L1 mRNA的表達(dá)沒有明顯差異(Fig 5E)。

Fig 5 PD-L1-lnc對小鼠肺癌移植瘤生長的影響

3. PD-L1-Lnc激活c-Myc信號通路促進(jìn)癌癥進(jìn)展

過表達(dá)PD-L1-Lnc上調(diào)的基因大部分在PD-L1-Lnc shRNA出現(xiàn)下調(diào)（Fig. 6A）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些基因約20%參與了c-Myc信號通路(Fig.6B)。

將變化顯著并參與了c-myc信號通路的基因進(jìn)行q-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞系和肺癌異種移植中，過表達(dá)或干擾PD-L1-Lnc后，這些基因的表達(dá)產(chǎn)生明顯變化(Fig 6C)。此外，將過表達(dá)的PD-L1-Lnc和干擾的c-Myc siRNA共轉(zhuǎn)染到這些基因中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Myc siRNA顯著減弱了原本PD-L1-Lnc過表達(dá)對這些的促進(jìn)作用(Fig 6C)。作者進(jìn)一步研究PD-L1-Lnc 和 c-Myc之間存在怎樣的聯(lián)系，MYC家族在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡中如何發(fā)揮作用，將生物素偶連的反義寡核苷酸固化在鏈霉親和素磁珠上進(jìn)行C-Myc沉淀，將生物素標(biāo)記的探針作為陰性對照，WB結(jié)果顯示PD-L1-Lnc和c-Myc出現(xiàn)了免疫共沉淀(Fig 6D)，接下來在細(xì)胞中通過A/G蛋白質(zhì)瓊脂糖珠使其與c-Myc抗體結(jié)合，過表達(dá)PD-L1-Lnc、敲低PD-L1-Lnc (Fig 6E.左圖)進(jìn)行比較， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)c-Myc抗體組中檢測到了PD-L1-Lnc，然而在IgG對照組中沒有檢測到PD-L1-Lnc(Fig.6 E， 右圖)。

Fig 6 PD-L1-lnc與c-Myc結(jié)合，激活c-Myc下游信號通路

c-Myc可以與PD-L1-Lnc的雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合（Fig 7A），作者接下來預(yù)測了7個C-Myc與PD-L1-Lnc可能的結(jié)合位點，為進(jìn)一步驗證，作者構(gòu)建了兩個預(yù)測結(jié)合位點突變(PDL1- Lnc mut)或缺失(PD-L1-Lnc del) 載體(Fig 7B)，將其轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn) PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)不受影響。免疫沉淀試驗表明，c-Myc與野生型PD-L1-Lnc產(chǎn)生免疫共沉淀，進(jìn)一步通過pulldown觀察PD-L1-Lnc與c-Myc的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)只有野生型PD-L1-Lnc GFP mRNA與c-Myc進(jìn)行結(jié)合，而突變型PD-L1-Lnc GFP mRNA未和Myc結(jié)合（Fig 7C），免疫共沉淀實驗再次驗證了這一點（Fig 7D）。

已有研究表明，c-Myc的螺旋-環(huán)-螺旋Zip基序可以與伴侶蛋白Max形成異源二聚體，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄（Fig 7A）。作者提出假設(shè)，PD-L1-Lnc可以通過改變c-Myc構(gòu)象來增強c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，從而與Max形成異源聚合物，為檢驗這個假設(shè)，研究中轉(zhuǎn)染PD-L1-Lnc過表達(dá)載體的細(xì)胞中Max蛋白水平顯著高于轉(zhuǎn)染對照載體的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染PD-L1-Lnc shRNA的細(xì)胞中Max蛋白水平顯著減低（Fig 7E）。在A549細(xì)胞系中， 免疫熒光標(biāo)記顯示PD-L1-lnc過表達(dá)顯著增強細(xì)胞中c-Myc的核易位（Fig 7F）。western blot分析也顯示PD-L1-lnc過表達(dá)增加了c-Myc的核分布，而c-Myc的總細(xì)胞水平保持不變(Fig 7G)。

Fig 7G PD-L1-lnc與c-Myc的結(jié)合能增強了c-Myc與Max的結(jié)合，促進(jìn)了c-Myc核易位

為進(jìn)一步驗證PD-L1-Lnc是否通過c-Myc信號通路行使自身功能，作者通過c-Myc siRNA下調(diào)了c-Myc的表達(dá)，觀察PD-L1-lnc過表達(dá)是否影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡，發(fā)現(xiàn)將過表達(dá)PD-L1-Lnc將會增強細(xì)胞增殖、侵襲能力并抑制細(xì)胞的凋亡（Fig 8A-C）。通過c-Myc siRNA敲除c-Myc，細(xì)胞增殖、侵襲能力并抑制細(xì)胞的凋亡能力明顯下降（Fig 8A-C）。

Fig。 8  PD-L1-lnc通過c-Myc信號通路促進(jìn)肺癌進(jìn)展

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)PD-L1基因通過選擇性剪接將會產(chǎn)生另一個PD-L1轉(zhuǎn)錄本PD-L1-Lnc，PD-L1-lnc通過增強c-Myc轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)LUAD增殖、轉(zhuǎn)移和生存,為肺癌治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

PD-L1 lncRNA splice isoform promotes lung adenocarcinoma progression via enhancing c-Myc activity[J]。 Genome Biology， 2021， 22(1)。