外泌體linc-ROR介導(dǎo)癌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間的串?dāng)_，促進(jìn)胰腺癌腫瘤的生長(zhǎng)

   胰腺癌(PC)是最棘手的癌癥之一，被認(rèn)為是預(yù)后最差的消化系統(tǒng)腫瘤。外泌體是微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間相互交流的重要介質(zhì)。腫瘤的發(fā)展不僅由癌細(xì)胞決定，還受腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)中缺氧、脂質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞這三個(gè)重要因素的調(diào)控。肥胖與包括PC在內(nèi)的幾種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，并增加PC的發(fā)病率和死亡率。然而，PC衍生的外泌體在TME的進(jìn)展和與脂肪細(xì)胞的串?dāng)_中的潛在分子機(jī)制尚未闡明。因此，有作者對(duì)此進(jìn)行了研究，并把研究結(jié)果發(fā)表在《Molecular Therapy - Nucleic Acids》，IF：8.886。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. PC細(xì)胞衍生的linc-ROR相關(guān)外泌體的特性和作用

為了研究外泌體對(duì)PC細(xì)胞釋放的脂肪細(xì)胞的影響，從培養(yǎng)基的上清(無(wú)外泌體血清)中分離出外泌體，并通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)和納米顆粒跟蹤分析(NTA)進(jìn)行定量。透射電鏡顯示直徑為30 ~ 150 nm的清晰圓形顆粒(圖1A)，NTA顯示出類(lèi)似大小的外泌體分布(圖1B和1C;)來(lái)源于PANC-1和BxPC-3細(xì)胞。在建立的PC細(xì)胞系(PANC-1, AsPC-1, MIA-PACA-2, CFPAC-1和BxPC-3)中觀察到linc-ROR的表達(dá)高于永生的正常胰腺細(xì)胞系(CCCHPE- 2)(圖1D)。此外，外泌體linc-ROR的差異表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)linc-ROR一致(圖1E)。Western blot分析從CC-HPE-2、PAN-1和BXPC-3細(xì)胞上清分離的外泌體中提取的蛋白，顯示了外泌體蛋白CD9和TSG101的存在(圖1F)。接下來(lái)，研究外泌體linc-ROR的穩(wěn)定性。從PANC-1上清液中分離出的外泌體作為參考，用RNase A (10 mg/mL)培養(yǎng)0、30、60和90 min，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量外泌體linc-ROR表達(dá)(圖1G)。此外共聚焦顯微鏡證實(shí)了脂肪細(xì)胞攝取PC細(xì)胞外泌體的能力(圖1H和2C)。脂肪細(xì)胞作為受體細(xì)胞，對(duì)PC細(xì)胞的外泌體具有吸收效率，表明外泌體linc-ROR可傳遞給脂肪細(xì)胞，在PC細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

圖1 PC細(xì)胞衍生的外泌體的特征和作用

2. PC細(xì)胞衍生的外泌體中linc-ROR表達(dá)的增加可以轉(zhuǎn)移到脂肪細(xì)胞中，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)去分化

作者接下來(lái)使用體外間接共培養(yǎng)模型研究了外泌體linc-ROR在誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞去分化中的作用(圖2A)。為了探究外泌體linc-ROR在脂肪細(xì)胞脫分化中的作用機(jī)制，作者繼續(xù)誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞5天，使其成為具有獨(dú)特脂滴的成熟脂肪細(xì)胞(圖2B)。脂滴經(jīng)紅油染色呈規(guī)則的圓形。當(dāng)從PC細(xì)胞中分離出來(lái)的外泌體(綠色熒光染料，pkh67標(biāo)記)與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)顯示，受體細(xì)胞(藍(lán)色熒光染料，DAPI標(biāo)記)隨著時(shí)間的增加表達(dá)更高的攝取潛能(圖2C)。這證實(shí)了吸收能力是依賴(lài)于時(shí)間的。

在與轉(zhuǎn)染sh陰性對(duì)照(CoshCtrl)的PANC-1細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中，與轉(zhuǎn)染shROR (CoshROR)相比，成熟脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出脂滴明顯減少，細(xì)胞外觀呈拉長(zhǎng)狀，類(lèi)似成纖維細(xì)胞的形態(tài)(圖2D)。為了確定外泌體linc-ROR誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞脫分化的機(jī)制，采用western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析PID 11不同實(shí)驗(yàn)條件下脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)水平。正如預(yù)期的那樣，在一些成熟的脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)記物，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4 (GLUT4)、增殖激活受體γ (ppar)和激素敏感脂肪酶(HSL)的表達(dá)方面，我們觀察到，與CoshROR或單個(gè)脂肪細(xì)胞(PBS-Adi)組相比，CoshCtrl組明顯降低了它們的表達(dá)水平(圖2E)。此外，還檢測(cè)了一些成纖維細(xì)胞特異性基因的表達(dá)水平，如α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶11 (MMP11)和膠原蛋白I(圖2E)。共培養(yǎng)6天后其表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步支持脂肪細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的脫分化過(guò)程。

圖2 PC細(xì)胞衍生的外泌體中linc-ROR表達(dá)水平的升高可以通過(guò)共培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)去分化

3. 脂肪細(xì)胞通過(guò)外泌體linc-ROR去分化促進(jìn)PC腫瘤的發(fā)生

功能上，菌落形成分析的結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)體系中，敲低/過(guò)表達(dá)外泌體linc-ROR表達(dá)顯著降低/增強(qiáng)了PC細(xì)胞的生長(zhǎng)活力(圖3A和3B)，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析(RTCA) xCELLigence實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了類(lèi)似的結(jié)果(圖3C和3D)。如圖所示，共培養(yǎng)/較高linc-ROR組比各自的對(duì)照組表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)。這些結(jié)果也被EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)(圖3G和3H)。綜上所述，外泌體linc-ROR表達(dá)較高的脂肪細(xì)胞脫分化后，PC細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。

圖3 脂肪細(xì)胞通過(guò)外泌體linc-ROR去分化促進(jìn)PC腫瘤的發(fā)生

4. 脂肪細(xì)胞和PC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)PC細(xì)胞的遷移、侵襲和形態(tài)改變，并伴有EMT

研究結(jié)果還表明，與PBS-shCtrl/PBS-Ctrl相比，脂肪細(xì)胞和外泌體linc-ROR共培養(yǎng)體系的條件培養(yǎng)基增強(qiáng)了PC細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)性(圖4A和4B)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)由外泌體linc-ROR表達(dá)增加引起的脂肪細(xì)胞脫分化使PC細(xì)胞更有運(yùn)動(dòng)能力，如圖4A和4B所示(圖4A和4B)。此外，經(jīng)外泌體linc-ROR處理的脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基在很大程度上誘導(dǎo)PC細(xì)胞通過(guò)Transwell過(guò)濾器遷移和侵襲(圖4C和4F)。圖像還顯示，條件培養(yǎng)液改變了PC細(xì)胞的形態(tài)，從凝聚型轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚⑿?/span>(圖5B)，典型表現(xiàn)為細(xì)胞間連接丟失和細(xì)胞偽足擴(kuò)展，免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)顯示，間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白表達(dá)增加，上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)減少(圖5A)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了外泌體linc-ROR的表達(dá)增加，通過(guò)共培養(yǎng)系統(tǒng)作用于脂肪細(xì)胞，促進(jìn)體外PC轉(zhuǎn)移。

圖4 脂肪細(xì)胞和PC細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲

圖5 共培養(yǎng)系統(tǒng)改變了PANC-1細(xì)胞的形態(tài)，誘導(dǎo)了EMT

5. 外泌體linc-ROR通過(guò)激活HIF1α/ZEB1信號(hào)通路和白細(xì)胞介素-1b (IL-1b)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞去分化，促進(jìn)PC細(xì)胞的EMT

接下來(lái)，作者深入研究了外泌體linc-ROR和脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基在PC微環(huán)境中的生物學(xué)功能。如圖6A所示，只有外泌體linc-ROR增加的脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出脫分化，最終隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(0 h、24 h和48 h)促進(jìn)HIF1α的表達(dá)。此外，還測(cè)量了與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)(圖6B)。結(jié)果表明，脂肪細(xì)胞在共培養(yǎng)過(guò)程中不僅促進(jìn)了HIF1α的表達(dá)，而且隨著時(shí)間的推移也促進(jìn)了ZEB1的表達(dá)。在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，HIF1α在ZEB1信號(hào)通路的有效重組中發(fā)揮了核心作用。使用實(shí)時(shí)定量PCR和western blotting來(lái)研究HIF1α是否在共培養(yǎng)條件下與作為對(duì)照的PBS激活ZEB1通路(圖6C)。正如預(yù)期的那樣，小干擾RNA (siRNA) (si-HIF1α)誘導(dǎo)的HIF1α的減少降低了ZEB1的表達(dá)。特別是HIF1α和共培養(yǎng)模型對(duì)ZEB1具有協(xié)同的正調(diào)控作用(圖6I)。

為了增加上述結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性，使用轉(zhuǎn)染了pLent-ROR的BxPC-3細(xì)胞來(lái)研究linc-ROR過(guò)表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致下游HIF1α-ZEB1表達(dá)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了linc- ROR和共培養(yǎng)條件在HIF1α-ZEB1信號(hào)通路中的有效性和可行性，并與plt陰性對(duì)照或pbs對(duì)照處理的BxPC-3細(xì)胞進(jìn)行了比較(圖6D-6F)。IL-1b等細(xì)胞因子在PC微環(huán)境中通過(guò)旁分泌信號(hào)在脂肪細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。因此，通過(guò)ELISA檢測(cè)了與脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)微環(huán)境中IL-1b的濃度(圖6G和6H)。數(shù)據(jù)顯示較高的外泌體linc-ROR可刺激脂肪細(xì)胞分泌IL-1b。此外，對(duì)PC細(xì)胞的western blot分析顯示，ZEB1誘導(dǎo)的EMT細(xì)胞發(fā)生了典型的變化，包括E-cadherin蛋白表達(dá)降低，而vimentin蛋白表達(dá)顯著升高(圖6C, 6F, 6I)。因此，這些結(jié)果表明，外泌體linc-ROR誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞脫分化，并提高PC細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT。

圖6 外泌體linc-ROR通過(guò)激活HIF1α-ZEB1信號(hào)通路和增加IL-1b，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞去分化，促進(jìn)PC細(xì)胞的EMT

6. 外泌體linc-ROR介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境可促進(jìn)PC細(xì)胞通過(guò)體內(nèi)脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)基生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步評(píng)估外泌體linc-ROR在脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型中的作用，從而促進(jìn)體內(nèi)PC增殖的進(jìn)程，將BxPC-3細(xì)胞與由BxPC-shCtrl (PBS-Ctrl和Co-Ctrl)衍生的外泌體刺激的脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基混合或轉(zhuǎn)染pLent-ROR (PBSpLent- ROR和CopLent-ROR)的脂肪細(xì)胞皮下接種裸鼠(圖7A)。用過(guò)表達(dá)的外泌體linc-ROR處理的去分化脂肪細(xì)胞在腫瘤內(nèi)注射條件培養(yǎng)基(每周3次)可在不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生最大的腫瘤生長(zhǎng)體積(圖7B)。5周后，觀察到BxPC-3細(xì)胞與CopLent-ROR混合產(chǎn)生的腫瘤結(jié)節(jié)比BxPC-3細(xì)胞單獨(dú)(Co-Ctrl)或PBS-Ctrl混合產(chǎn)生的腫瘤結(jié)節(jié)更大(圖7C)。PBS-Ctrl組和PBS-pLent-ROR組Ki-67蛋白表達(dá)顯著低于Co-Ctrl組和CopLent-ROR組(圖7D)。這些結(jié)果表明，TME中的外泌體linc-ROR誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞脫分化，促進(jìn)體內(nèi)PC生長(zhǎng)。同時(shí)，以往的外泌體表征研究表明，外泌體包裹的linc-ROR在膜的保護(hù)下具有更好的穩(wěn)定性(圖1G和1H)，這是良好的生物標(biāo)志物的必要前提。為了驗(yàn)證血清中外泌體linc-ROR的診斷性能，在同一驗(yàn)證隊(duì)列中測(cè)量了它的表達(dá)(圖7E)。此外，根據(jù)48例PC患者和48例健康個(gè)體的外泌體linc-ROR表達(dá)情況進(jìn)行受試者-操作特征(ROC)曲線分析(圖7F)。如預(yù)期，外泌體linc-ROR檢測(cè)PC的ROC曲線下面積(AUC)為0.854。血清外泌體linc-ROR預(yù)測(cè)PC的最佳臨界值為1.21086 (CRC與健康人相比的fold change)，敏感性為72.92%，特異性為95.83%，提示外泌體linc-ROR是一種有前景的診斷PC的血清生物標(biāo)志物。

圖7 外泌體linc-ROR介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境可促進(jìn)PC細(xì)胞通過(guò)體內(nèi)脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)基生長(zhǎng)

主要結(jié)論：

該研究結(jié)果表明，外泌體linc-ROR不僅作為PC的臨床生物標(biāo)志物，還介導(dǎo)了TME中PC細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間的串話。暴露于外泌體后，活化的脂肪細(xì)胞可能通過(guò)釋放細(xì)胞因子IL-1b去分化為前脂肪細(xì)胞/成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，IL-1b反過(guò)來(lái)通過(guò)HIF1α-ZEB1軸維持PC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(圖8)。

圖8 PC細(xì)胞來(lái)源的外泌體linc-ROR誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞去分化為前脂肪細(xì)胞/成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞因子IL-1b激活HIF1α-ZEB1信號(hào)通路維持PC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲