LINC00941通過調(diào)節(jié)Hippo途徑促進(jìn)胰腺癌糖酵解

胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是最致命的癌癥之一。缺乏有效的治療和PDAC發(fā)病率的增加促使人們對(duì)PDAC進(jìn)展有更深入的了解。2021年7月發(fā)表于Molecular Therapy: Nucleic Acids（IF=8.886）的文章“LINC00941 promotes glycolysis in pancreatic cancer by modulating the Hippo pathway”報(bào)道了LINC00941通過調(diào)節(jié)Hippo途徑促進(jìn)胰腺癌糖酵解。通過分析lncRNA數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)LINC00941表達(dá)增加導(dǎo)致PDAC患者預(yù)后不良。此外，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明LINC00941通過促進(jìn)有氧糖酵解促進(jìn)PDAC癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在機(jī)理上，LINC00941被發(fā)現(xiàn)與MST1相互作用，促進(jìn)PP2A介導(dǎo)的MST1去磷酸化，導(dǎo)致Hippo途徑激活，從而增強(qiáng)PDAC的糖酵解。這些結(jié)果表明LINC00941在PDAC腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是PDAC治療的新途徑。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）PDAC中LINC00941表達(dá)增加與疾病進(jìn)展和預(yù)后不良呈正相關(guān)

我們比較了lncRNA在胰腺癌和配對(duì)的相鄰非腫瘤胰腺組織樣本中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)化胰腺組織相比，有34個(gè)lncRNAs顯著上調(diào)，32個(gè)lncRNAs在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖1A)。接下來，我們分析了前兩個(gè)上調(diào)的lncRNAs-LINC00941和LINC01234與TCGA數(shù)據(jù)集的臨床結(jié)果的相關(guān)性。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，LINC01234對(duì)胰腺癌患者的總生存期無預(yù)測(cè)價(jià)值，而LINC00941與胰腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖1B)。與GEO的數(shù)據(jù)集一致，我們發(fā)現(xiàn)LINC00941在PDAC TCGA數(shù)據(jù)集中與正常胰腺GTEx數(shù)據(jù)集相比高表達(dá)(圖1C和1D)。為了驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)，我們采用real-time PCR檢測(cè)了10例配對(duì)胰腺癌及癌旁組織中LINC00941的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)LINC00941在PDAC組織中表達(dá)顯著增加(圖1E)。此外，我們通過原位雜交(ISH)驗(yàn)證了LINC00941在石蠟包埋的胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，LINC00941主要定位于PDAC細(xì)胞質(zhì)，且LINC00941在胰腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(圖1F)。接下來，我們?cè)u(píng)估TCGA數(shù)據(jù)集中LINC00941表達(dá)與不同臨床病理特征的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)LINC00941的表達(dá)與腫瘤大小和腫瘤分期呈正相關(guān)(圖1G)。與TCGA隊(duì)列研究結(jié)果一致，在PDAC患者中，LINC00941高水平表達(dá)與縮短生存時(shí)間顯著相關(guān)。

2）LINC00941體外抑制PDAC癌細(xì)胞生長(zhǎng)

為了揭示LINC00941在胰腺癌進(jìn)展中的作用，我們?cè)趦蓚€(gè)高表達(dá)LINC00941的PDAC癌細(xì)胞系PANC-1和SW1990中沉默LINC00941的表達(dá)(圖2A)。LINC00941的shRNA顯著抑制了LINC00941在PDAC細(xì)胞株中的表達(dá)(圖2B)。細(xì)胞活力測(cè)定顯示LINC00941的缺失極大地抑制了PANC-1和SW1990細(xì)胞的增殖(圖2C)。相比之下，LINC00941過表達(dá)顯著促進(jìn)了兩種LINC00941表達(dá)相對(duì)較低的PDAC癌細(xì)胞BxPC-3和CFPAC-1的生長(zhǎng)(圖2D)。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，LINC00941的敲除顯著抑制了PDAC癌細(xì)胞的集落形成能力(圖2E)。為了進(jìn)一步模擬體內(nèi)生長(zhǎng)條件，采用三維生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)比較LINC00941沉默的PDAC細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。與2D培養(yǎng)一致，LINC00941的缺失顯著抑制了PDAC細(xì)胞株的球形生長(zhǎng)(圖2F)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，抑制LINC00941會(huì)損害PDAC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3）LINC00941耗盡抑制PDAC細(xì)胞的糖酵解

我們旨在闡明LINC00941調(diào)控PDAC癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。我們觀察到當(dāng)在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)至相同的濃度時(shí)，對(duì)照PDAC細(xì)胞培養(yǎng)基中的酚紅呈現(xiàn)出由紅色逐漸變?yōu)辄S色的顏色轉(zhuǎn)變，而LINC00941-沉默的腫瘤細(xì)胞株則沒有這種顏色轉(zhuǎn)變(圖3A)。這些結(jié)果表明LINC00941抑制了細(xì)胞外酸性的產(chǎn)生。通過對(duì)細(xì)胞外pH值的測(cè)量證實(shí)，來自對(duì)照腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基逐漸變得酸性更強(qiáng)，而來自LINC00941沉默的腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)基并沒有像來自對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)基那樣很快變得酸性(圖3B)。LINC00941基因的下調(diào)顯著抑制了PANC-1和SW1990細(xì)胞的糖酵解能力(圖3C和3D)。因此，我們測(cè)量了糖酵解途徑中酶的mRNA表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，沉默LINC00941后，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT1)、己糖激酶2 (HK2)、PFKFB3和乳酸脫氫酶A (LDHA) mRNA的表達(dá)顯著降低(圖3E和3F)。此外，我們比較了LINC00941 sh陰性對(duì)照(shNC)、sh1和sh2 PDAC細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成。正如預(yù)期的那樣，LINC00941基因的下調(diào)顯著抑制了PDAC癌細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(圖3G和3H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LINC00941的缺失抑制了PDAC細(xì)胞中的糖酵解。

4）糖酵解是LINC00941介導(dǎo)的生長(zhǎng)促進(jìn)所必需的

我們旨在評(píng)估增強(qiáng)的糖酵解對(duì)于LINC00941介導(dǎo)的PDAC細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用是否必要。。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2-DG極大地破壞了LINC00941過表達(dá)誘導(dǎo)的BxPC-3和CFPAC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用(圖4A和4 B)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，將培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為半乳糖以抑制糖酵解。如預(yù)期的那樣，在半乳糖替代后乳酸產(chǎn)量顯著降低。與此同時(shí)，異位表達(dá)LINC00941的BxPC-3和CFPAC-1細(xì)胞的增殖急劇下降(圖4C和4D)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LINC00941高表達(dá)組比LINC00941低表達(dá)組有更高的最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)值，GLUT1、HK2、PFKFB3、LDHA染色更強(qiáng)(圖4E，4G)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，糖酵解對(duì)于LINC00941介導(dǎo)的生長(zhǎng)促進(jìn)作用是必要的。

5）LINC00941激活Hippo通路，增強(qiáng)PDAC細(xì)胞的糖酵解

我們旨在揭示LINC00941增強(qiáng)PDAC細(xì)胞糖酵解的信號(hào)通路。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LINC00941顯著提高了PANC-1細(xì)胞中TEAD1的轉(zhuǎn)錄活性(圖5A)，提示Hippo途徑可能介導(dǎo)了LINC00941對(duì)糖酵解的調(diào)控。因此，我們檢測(cè)了Hippo途徑下游三個(gè)典型基因CTGF、CYR61和ANKRD1的表達(dá)。結(jié)果顯示，LINC00941基因敲除顯著降低了這三個(gè)靶基因在PANC-1和SW1990 PDAC細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平(圖5B)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，我們通過免疫熒光染色檢測(cè)了YAP1在對(duì)照和LINC00941沉默的PDAC細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置。我們發(fā)現(xiàn)，在LINC00941 sh1和sh2 pan -1細(xì)胞中，YAP1核定位的比例遠(yuǎn)高于對(duì)照細(xì)胞(圖5C和5D)。接下來，用免疫印跡法檢測(cè)LINC00941沉默的PDAC細(xì)胞株中Hippo通路的改變。結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，LINC00941敲低細(xì)胞中MST1、LATS1和YAP1的磷酸化水平明顯上調(diào)(圖5E)。為了進(jìn)一步確定LINC00941在PDAC中的致癌作用是否需要YAP1，將兩個(gè)YAP1突變體引入LINC00941過表達(dá)或LINC00941缺失的PDAC細(xì)胞中。正如預(yù)期的那樣，組成型激活的YAP1 (S127A)的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LINC00941耗盡的PDAC細(xì)胞的生長(zhǎng)受損(圖5F)。同樣，Hippo途徑的抑制劑verteporfin也會(huì)阻礙LINC00941過表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5G)。此外，ECAR測(cè)量結(jié)果顯示，YAP1 (S127A)過表達(dá)恢復(fù)了LINC00941耗盡PDAC細(xì)胞中受損的糖酵解，YAP1 (S94A)過表達(dá)阻礙了LINC00941過表達(dá)介導(dǎo)的糖酵解增強(qiáng)(圖5H)。因此，我們假設(shè)YAP1可以轉(zhuǎn)化糖酵解酶的表達(dá)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，YAP1 S127A突變體在LINC00941敲低PDAC細(xì)胞中可以逆轉(zhuǎn)GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA的表達(dá)，而YAP1 S94A突變體則不能(圖5I)。此外，ChIP-PCR結(jié)果顯示YAP1可以直接結(jié)合GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA基因的啟動(dòng)子。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Hippo途徑是LINC00941誘導(dǎo)糖酵解增強(qiáng)的中介。

6）LINC00941促進(jìn)PP2A介導(dǎo)的MST1去磷酸化，觸發(fā)Hippo通路

為了闡明LINC00941激活Hippo通路的機(jī)制，我們首先確定了LINC00941在PDAC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。ISH染色結(jié)果顯示LINC00941主要定位于PDAC細(xì)胞的胞質(zhì)(圖6A)。此外，通過LINC00941 RNA下拉和質(zhì)譜分析，篩選與LINC00941相互作用的潛在蛋白(圖6B)。結(jié)果表明，Hippo途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一MST1可以與LINC00941互作。免疫印跡數(shù)據(jù)顯示LINC00941可與MST1相互作用(圖6C)。為了進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用，我們對(duì)PANC-1細(xì)胞株進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)。如圖6D和6E所示，凝膠電泳和qPCR均能在MST1沉淀中檢測(cè)到LINC00941，而在免疫球蛋白G (IgG)沉淀中檢測(cè)不到LINC00941(圖6D和6E)。為了明確LINC00941和MST1相互作用的確切區(qū)域，我們構(gòu)建了一系列截?cái)嗟腖INC00941變體。LINC00941的800到1500核苷酸被發(fā)現(xiàn)與MST1結(jié)合(圖6F)。競(jìng)爭(zhēng)性RNA下拉實(shí)驗(yàn)及MST1和LINC00941免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)LINC00941與MST1相互作用(圖6G和6H)。coIP結(jié)果顯示，在LINC00941沉默的細(xì)胞中，MST1和PP2A之間的相互作用比對(duì)照細(xì)胞弱(圖6I)。此外，PP2A沉默抵消了BXPC-3和CFPAC-1細(xì)胞中增強(qiáng)的糖酵解和促生長(zhǎng)作用(圖6J, 6K)。綜上所述，這些結(jié)果表明LINC00941促進(jìn)PP2A介導(dǎo)的MST1去磷酸化，從而觸發(fā)Hippo通路。

7）靶向LINC00941可阻礙PDAC在體內(nèi)的進(jìn)展

我們?cè)u(píng)估LINC00941缺失是否在體內(nèi)干擾PDAC的形成。結(jié)果顯示，注射對(duì)照細(xì)胞的小鼠比注射LINC00941敲除細(xì)胞的小鼠發(fā)生了更大的腫瘤(圖7A)。腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)分析(Vs)表明，來自對(duì)照細(xì)胞的皮下移植瘤比來自shLINC00941細(xì)胞的移植瘤發(fā)育得更快(圖7B)。注射shLINC00941細(xì)胞的小鼠的腫瘤負(fù)荷低于對(duì)照組注射細(xì)胞的小鼠(圖7C)。免疫組化(IHC)染色分析顯示，來自shLINC00941細(xì)胞的腫瘤比來自shNC細(xì)胞的腫瘤表現(xiàn)出更弱的PCNA、YAP1、GLUT1、HK2和LDHA染色(圖7D)。體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)結(jié)果顯示，LINC00941的缺失降低了PDAC細(xì)胞的侵襲性(圖7E)，延長(zhǎng)了異種移植小鼠的總存活率(圖7F)。為確定與一線藥物的潛在協(xié)同作用，給予吉西他濱(50 mg/kg)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用LINC00941缺失或吉西他濱治療的小鼠相比，使用shLINC00941聯(lián)合吉西他濱治療的小鼠腫瘤更小，總生存期更長(zhǎng)(圖7F)。與LINC00941缺失組或吉西他濱單獨(dú)處理組相比，shLINC00941 +吉西他濱組小鼠的切片顯示出較弱的PCNA, YAP1, GLUT1, HK2和LDHA染色(圖7G)。因此，LINC00941的缺失降低了腫瘤負(fù)擔(dān)，并減弱了PDAC在體內(nèi)的進(jìn)展。

   結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)，在PDAC中LINC00941高表達(dá)與預(yù)后不良呈正相關(guān)。功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)表明LINC00941促進(jìn)PDAC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和糖酵解。機(jī)理研究表明LINC00941通過促進(jìn)MST1去磷酸化促進(jìn)YAP1核定位和下游糖酵解相關(guān)基因表達(dá)。此外，體內(nèi)研究表明LINC00941缺失可抑制PDAC的進(jìn)展。