本是同根生：M1-exo工程化以促進M2型TAM向M1轉(zhuǎn)變
M2極化是抗腫瘤巨噬細(xì)胞，即與M1極化相比，促腫瘤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）高表達白細(xì)胞介素-4受體（IL4R）。本研究中，作者利用M1巨噬細(xì)胞來源的外泌體，通過重編程TAMs為M1型巨噬細(xì)胞，從而促進M1極化和靶向IL4R，最終抑制腫瘤生長。本文于2021年9月發(fā)表在《Biomaterials》IF：12.479期刊上。
技術(shù)路線：
主要實驗結(jié)果：
1、M1外泌體的特性以促進M1極化和靶向IL4R
如圖1A所示，超離心法從M1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基分離出每只小鼠20 ~ 30 μg的外泌體。然后為了通過IL4R靶向M2巨噬細(xì)胞，使用DOPE-PEG-NHS膜磷脂為基礎(chǔ)的錨定物（IL4Rp-1-Exo(si/mi)），用IL4Rp-1對Exo(si/mi)進行表面修飾。NTA分析顯示M1外泌體、Exo(si/mi)、IL4R-Exo(si/mi)和IL4Rpep -1標(biāo)記的M1外泌體(IL4R-Exo)相似（圖1B-1E）。此外，M1和M2巨噬細(xì)胞外泌體都有相似水平的Alix和CD63表達，但是M1有更高的iNOS表達和更富豐的促炎性因子（IL-6，IL-12，IFN-γ）；并且細(xì)胞裂解液中含有細(xì)胞標(biāo)記物，如鈣聯(lián)蛋白和組蛋白，但外泌體中不含，這表明外泌體中不含死細(xì)胞的細(xì)胞碎片（圖1F-1G）。
圖1 IL4R靶向M1外泌體的制備與表征
隨后，為了檢測血漿中IL4RPep-1在外泌體膜的保留時間，作者使用CD63抗體捕獲外泌體，用流式檢測其表達，結(jié)果如圖2B-2D所示，直至孵育后24小時內(nèi)外泌體表達都沒有顯著改變，IL4RPep-1的血漿穩(wěn)定性也在24小時內(nèi)穩(wěn)定不變。表明用DOPE-PEG-NHS錨定的IL4RPep-1外泌體至少可以在血漿中穩(wěn)定存在24小時。
圖2 IL4RPep-1的保留和血清穩(wěn)定性，NF-κB p50 siRNA和miR-511-3p的包封入M1外泌體
2、IL4R-靶向的M1外泌體可有效被內(nèi)化和傳輸至M2巨噬細(xì)胞并激活M1極化
如圖3A和圖3C所示，相比于未標(biāo)記的外泌體，IL4R-Exo和多肽標(biāo)記的外泌體（Ctrl-Exo）都可以被M1巨噬細(xì)胞有效內(nèi)化，但是，相反的是，與Ctrl-Exo相比，IL4R-Exo可以更為有效的被M2巨噬細(xì)胞內(nèi)化（圖3B和圖3C）。IL4R-Exo(si)負(fù)載紅色熒光標(biāo)記的對照siRNA可以更有效的將siRNA傳遞入M2巨噬細(xì)胞，與untargeted Exo(si)相比，但該過程可以被IL4R阻斷性抗體抑制（圖3D）。此外，IL4R-Exo(si)裝載miR-511–3p運輸至M2巨噬細(xì)胞的效率也更高，如圖3E。
圖3通過IL4R靶向的M1-Exo將siRNA和miRNA內(nèi)化并傳遞到M2巨噬細(xì)胞
隨后，檢測IL4R-Exo(si/mi)能否有效的下調(diào)M2巨噬細(xì)胞中靶基因的表達。結(jié)果如圖4所示，IL4R-Exo(si/mi)降低了NF-κB p50和ROCK2的表達，以及M2標(biāo)志物Arg1和IL-10表達，同時增加了M1標(biāo)志物IL12p40和iNOS的表達。這表明靶向M2巨噬細(xì)胞的IL4R可以使M1來源外泌體有效的傳遞siRNA和miRNA進入M2巨噬細(xì)胞，隨即下調(diào)靶基因的表達促進巨噬細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型。
為了驗證M1來源外泌體對于促進M2重編程的效果，作者加入了非免疫性的正常細(xì)胞HEK 293來源的外泌體（(HEK-Exo），結(jié)果顯示它不能影響NF-κB p50和ROCK2的表達，以及M1和M2標(biāo)志物的表達（圖4）。再次證實了IL4R-Exo(si/mi)能有效調(diào)控M2巨噬細(xì)胞重編程。
圖4 IL4R靶向的M1外泌體對靶基因和巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物的調(diào)控
3、IL4R靶向的M1外泌體在小鼠中聚集于腫瘤但很少在肝臟分布
研究表明大量系統(tǒng)管理的外泌體在體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中積累，特別是在肝臟中。于是，作者檢測了是否IL4R靶向的M1外泌體表面修飾可以減少肝臟的系統(tǒng)性外泌體攝取而增強其腫瘤集聚的活性。對于體內(nèi)追蹤，這里使用的是DiD熒光標(biāo)記外泌體和4T1負(fù)荷乳腺癌腫瘤。將表達熒光素酶的4T1-luc腫瘤細(xì)胞接種到乳腺脂肪墊中，通過全身生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤生長（圖5A）。外泌體注射2小時后拍攝的全身熒光成像顯示，IL4R-Exo(si/mi)歸屬于腫瘤區(qū)域，而M1外泌體和對照肽標(biāo)記的Ctrl-Exo(si/mi)分布于全身，腫瘤歸屬較少（圖5B）。體外組織成像和定量顯示，從IL4R-Exo(si/mi)組分離出的腫瘤具有更高水平熒光信號，而M1外泌體對照組則是在肝，肺，脾中顯著聚集，Ctrl-Exo(si/mi)組則分布全身少量聚集于腫瘤（圖5C-5D）。此外，與Ctrl-Exo(si/mi)相比，IL4R靶向外泌體顯著富集于腫瘤，并且和IL4R和CD206在腫瘤里有明顯共定位表達（圖5E-5F）。
4、IL4R靶向的M1外泌體抑制腫瘤生長，重編程M2型TAM向M1型轉(zhuǎn)變，并增強抗腫瘤免疫
為了檢測IL4R-Exo(si/mi)的抗腫瘤生長活性，作者通過尾靜脈注射外泌體至4T1負(fù)載小鼠中（圖6A）。結(jié)果顯示IL4R-Exo(si/mi)可以顯著降低小鼠腫瘤的體積和腫瘤以及小鼠體重，同時下調(diào)腫瘤和淋巴結(jié)中NF-κB p50和ROCK2的表達。提示， IL4R-Exo(si/mi)具有抗腫瘤活性。
圖6 IL4R靶向的M1外泌體對4T1乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤生長活性及靶基因的下調(diào)
為了檢測IL4R-Exo(si/mi)重編程M2型TAM的能力，作者檢測了4T1腫瘤微環(huán)境中M2和M1標(biāo)志物的表達情況，結(jié)果如圖7A-F所示，IL4R-Exo(si/mi)顯著下調(diào)了M2型標(biāo)志物的表達，如Arg1，TFG-β，IL-10和IL-4，顯著增高了M1型標(biāo)志物的表達，如IL-12p40和IFN-γ。
之后，分析了治療后腫瘤組織中的免疫細(xì)胞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL4R-Exo(si/mi)顯著減少了免疫抑制的M2巨噬細(xì)胞，即含有細(xì)胞內(nèi)IL-10、MDSCs和Tregs的IL-10+巨噬細(xì)胞的數(shù)量，同時顯著增加了M1細(xì)胞群和CD8+ T細(xì)胞（圖7G-7M），但CD4+ T細(xì)胞的數(shù)量不受影響。
以上表明IL4R靶向的M1外泌體具有對4T1乳腺腫瘤小鼠的抗腫瘤生長活性及將M2巨噬細(xì)胞重編程為M1樣巨噬細(xì)胞并增加抗腫瘤免疫的能力。
圖7在4T1腫瘤微環(huán)境中，通過IL4R靶向M1外泌體將M2巨噬細(xì)胞重編程為M1樣巨噬細(xì)胞并增加抗腫瘤免疫
參考文獻：
Gunassekaran Gowri Rangaswamy., Poongkavithai Vadevoo Sri Murugan., Baek Moon-Chang., Lee Byungheon.(2021). M1 macrophage exosomes engineered to foster M1 polarization and target the IL-4 receptor inhibit tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages into M1-like macrophages. Biomaterials, 278(undefined), 121137. doi:10.1016/j.biomaterials.2021.121137