來自腎小管細(xì)胞的外泌體miR-21促進(jìn)腎纖維化

輸尿管梗阻引起的腎積水與腎纖維化和進(jìn)行性慢性腎病(CKD)有關(guān)。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞通訊被認(rèn)為與各種疾病有關(guān)，包括腎纖維化。然而，對(duì)于外泌體如何調(diào)節(jié)梗阻腎臟的腎纖維化知之甚少。2021年8月發(fā)表于Theranostics（IF=11.556）的文章“Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys“對(duì)此進(jìn)行了介紹。研究發(fā)現(xiàn)腎纖維化的增加與單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)的延長(zhǎng)天數(shù)有關(guān)，外泌體分泌在UUO腎和TGF-β1刺激的NRK-52E細(xì)胞中顯著增加。從TGF-β1刺激的NRK-52E細(xì)胞中純化的外泌體可激活成纖維細(xì)胞并加重腎纖維化。此外，Rab27a敲除或GW4869處理抑制外泌體分泌可消除成纖維細(xì)胞激活，改善腎纖維化。TGFβ1-Exos中外泌體miR-21較Ctrl-Exos明顯升高，且PTEN是miR-21的靶點(diǎn)。在體外，上皮外泌體miR-21的促進(jìn)或抑制相應(yīng)地加速或消除成纖維細(xì)胞的激活，而在體內(nèi)，miR-21缺陷的外泌體通過PTEN/Akt途徑緩解UUO后腎纖維化。我們的研究結(jié)果表明，來自腎小管上皮細(xì)胞的外泌體miR-21可能通過miR-21/PTEN/Akt通路激活成纖維細(xì)胞，從而加速腎纖維化的發(fā)展。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）UUO誘導(dǎo)的腎纖維化模型中TGF-β1的表達(dá)和外泌體的產(chǎn)生增加

我們首先通過Masson三色染色、Sirius紅染色、western blotting和免疫組化方法評(píng)估UUO-3d和UUO-7d模型腎纖維化和TGF-β1的表達(dá)(圖1A-H)。結(jié)果提示，TGF-β1表達(dá)和腎纖維化與梗阻天數(shù)呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步闡明外泌體是否在UUO模型中發(fā)揮作用，我們進(jìn)行了透射電鏡、免疫熒光和western blotting檢測(cè)。透射電鏡顯示UUO后細(xì)胞外囊泡分泌明顯增加。此外，許多細(xì)胞外囊泡的外泌體直徑為30-150 nm(圖1I)。CD63和TSG101(外泌體標(biāo)記物)的Western blot(圖1G和H)和免疫染色(圖1J-L)顯示，外泌體在UUO-3d組中明顯增加，在UUO-7d組中進(jìn)一步增加。此外，外泌體主要分布在腎小管上皮周圍(圖1J)。

2）TGF-β1促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞分泌外泌體，并在體外激活成纖維細(xì)胞

我們研究了腎小管來源的外泌體在介導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活中的潛在作用。TGF-β1作為主要的成纖維因子，用于刺激UUO腎損傷/應(yīng)激小管細(xì)胞的狀態(tài)。不同濃度TGF-β1伴或不伴GW4869孵育24小時(shí)后，NRK-52E細(xì)胞與無外泌體培養(yǎng)基孵育24小時(shí)，從條件培養(yǎng)基中收集外泌體來刺激正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F細(xì)胞)(圖2A)。如圖2B-D所示，NTA、DLS和TEM顯示大部分分離的細(xì)胞外囊泡為外泌體。CD63的Western blot分析證實(shí)，外泌體的分泌依賴于TGF-β1的濃度，而GW4869處理明顯抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積(圖2E-F)。隨后我們用PKH-67標(biāo)記NRK-52E細(xì)胞，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1處理后外泌體分泌增加(圖2G)。此外，PKH-67標(biāo)記的外泌體與NRK-49F細(xì)胞孵育后被成纖維細(xì)胞吸收(圖2H)。從TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞中分離的外泌體能夠誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞增殖和基質(zhì)生成，表現(xiàn)為α-SMA、PCNA、Col-I和纖連蛋白表達(dá)增加。而GW4869處理明顯逆轉(zhuǎn)了上述變化(圖2I-N)。

3）腎小管細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)體內(nèi)腎纖維化

為了研究腎小管來源的外泌體與UUO誘導(dǎo)的纖維化在體內(nèi)的相關(guān)性，我們使用UUO模型進(jìn)行了動(dòng)物研究，注射從TGF-β1處理的NRK-52E細(xì)胞中分離出來的TGFβ1-exos。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖3A所示。如圖3B所示，在體內(nèi)，我們觀察到NRK-52E細(xì)胞PKH-67標(biāo)記的TGFβ1-Exos存在于梗阻的腎臟中。此外，與Ctrl-Exo相比，注射TGFβ1-Exo可以明顯誘導(dǎo)CD63和TSG101的表達(dá)(圖3C-D)。然后我們檢測(cè)了外泌體注射對(duì)UUO腎臟的影響。如圖3E-L所示，與Ctrl-Exos相比，TGFβ1-Exos促進(jìn)了UUO后7天阻塞腎臟中成纖維細(xì)胞的增殖，并加劇了纖維連接蛋白和膠原沉積。

4）Rab27a敲除可抑制外泌體分泌，減輕UUO誘導(dǎo)的體內(nèi)腎纖維化

如圖4A-C所示，成功構(gòu)建并證實(shí)了Rab27a敲除小鼠(Rab27a-/-)。western blot檢測(cè)CD63的表達(dá)，表明敲除Rab27a可減少UUO腎臟的外泌體分泌(圖4D-E)。接下來我們檢查了成纖維細(xì)胞的激活和纖維連接蛋白和膠原的沉積。western blotting(圖4F, I)和免疫熒光(圖4F, H, J)檢測(cè)證實(shí)了敲除Rab27a明顯抑制了成纖維細(xì)胞的激活。同時(shí)，Masson染色，Col-I免疫組化染色和纖維連接蛋白免疫熒光染色證實(shí)，敲除Rab27a可通過抑制膠原蛋白和纖維連接蛋白沉積而改善UUO后腎纖維化(圖4G, K-M)。

5）腎小管細(xì)胞來源的外泌體miR-21促進(jìn)體外成纖維細(xì)胞活化

為了探究管狀細(xì)胞來源的外泌體miRNA是否發(fā)揮作用，我們進(jìn)行了miRNA測(cè)序(圖5A)。在所有改變的miRNA中，miR-21的升高最為顯著，我們進(jìn)一步證實(shí)，TGF-β1處理后，miR-21在NRK-52E細(xì)胞和NRK-52E傳遞的外泌體中被誘導(dǎo)(圖5D)。為了證實(shí)外泌體miR-21的作用，我們將miR-21模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染到NRK-52E細(xì)胞中，使其過表達(dá)或抑制外泌體miR-21(圖5B)，并通過PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果(圖5E)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和TGF-β1處理后，立即在NRK-49F細(xì)胞中加入相應(yīng)的外泌體。如圖5C和5F-I所示，miR-21模擬轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞的外泌體刺激NRK-49F細(xì)胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達(dá)及細(xì)胞增殖明顯增加。同樣，當(dāng)miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞的外泌體刺激NRK-49F細(xì)胞時(shí)，Col-I、纖連蛋白和α-SMA的表達(dá)以及細(xì)胞增殖均明顯下降。

6）PTEN是miR-21的一個(gè)潛在靶點(diǎn)

我們進(jìn)一步研究了腎小管細(xì)胞來源的外泌體miR-21介導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活的可能機(jī)制。TargetScan軟件預(yù)測(cè)PTEN基因的3 '-UTR是miR-21的保守結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。為了驗(yàn)證miR-21與PTEN的關(guān)系，我們構(gòu)建了攜帶PTEN 3’UTR的野生型PTEN (PTEN-WT)熒光素酶報(bào)告基因。將帶有PTEN-WT的miR-21模擬物轉(zhuǎn)染到NRK-49F細(xì)胞后，與Ctrl組相比，miR-21模擬物抑制了PTEN-miR-21轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的熒光素酶活性(圖6B)。最后，我們通過western blot檢測(cè)NRK-49F細(xì)胞中PTEN和下游p-Akt的表達(dá)水平。當(dāng)使用miR-21模擬轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞的外泌體刺激時(shí)，PTEN明顯降低，p-Akt升高，但當(dāng)使用miR-21抑制物轉(zhuǎn)染的NRK-52E細(xì)胞的外泌體刺激時(shí)，這些變化被緩解(圖6C-E)。

7）腎小管細(xì)胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路介導(dǎo)體外成纖維細(xì)胞激活

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-21在PTEN中的作用，NRK-49F細(xì)胞在接受NRK-52E遞送的外泌體之前，先用PTEN siRNA處理(圖7A)，與si-NC組相比，PTEN mRNA明顯受到抑制(圖7B)。CCK-8(圖7C)和PTEN的western blot表達(dá)(圖7H, K)表明，不經(jīng)外泌體干預(yù)的siPTEN轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)了NRK-49F的增殖。在外泌體干預(yù)組中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可抑制NRK-49F增殖，同時(shí)轉(zhuǎn)染siPTEN后明顯逆轉(zhuǎn)。免疫熒光染色顯示，轉(zhuǎn)染siPTEN后，NRK-49F細(xì)胞中Col-I、纖連蛋白和α-SMA表達(dá)明顯增加。在外泌體干預(yù)組中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可抑制上述指標(biāo)，同時(shí)轉(zhuǎn)染siPTEN后則明顯逆轉(zhuǎn)。western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋白PTEN和p-Akt，如圖7H-J所示。未經(jīng)外泌體干預(yù)的siPTEN轉(zhuǎn)染可顯著抑制PTEN，但加速p-Akt。在外泌體干預(yù)組中，單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可加速PTEN并抑制p-Akt，但與siPTEN共轉(zhuǎn)染后這種作用被逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果表明，腎小管細(xì)胞來源的外泌體miR-21可以通過PTEN/Akt途徑介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的激活。

8）腎小管細(xì)胞來源的外泌體miR-21通過PTEN/Akt通路促進(jìn)體內(nèi)腎纖維化

為驗(yàn)證外泌體miR-21在體內(nèi)的作用機(jī)制，采用TGFβ1-Exo注射UUO模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。NRK-52E細(xì)胞的TGFβ1-Exos在UUO后7天增加了細(xì)胞外基質(zhì)和成纖維細(xì)胞增殖。同時(shí)抑制腎小管細(xì)胞來源的外泌體中miR-21的表達(dá)可抑制成纖維細(xì)胞的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生(圖8A-D, 8E-G)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腎小管細(xì)胞來源的外泌體在UUO后下調(diào)PTEN并激活p-Akt。此外，外泌體中抑制miR-21可上調(diào)PTEN并抑制p-Akt(圖7F, H-I)。

  結(jié)論：我們證明了腎小管細(xì)胞來源的外泌體在輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎積水和長(zhǎng)期腎纖維化中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)UUO后含有miR-21的外泌體的產(chǎn)生增加。管狀細(xì)胞來源的外泌體miR-21通過靶向PTEN促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活，并影響PTEN/Akt通路。這些結(jié)果引入了一種新的機(jī)制，解釋了UUO模型中細(xì)胞-細(xì)胞通信是如何由外泌體介導(dǎo)的，并表明外泌體可能是一個(gè)新的開發(fā)領(lǐng)域，以延緩或減緩腎纖維化的進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：Zhao S, Li W, Yu W, Rao T, Li H, Ruan Y, Yuan R, Li C, Ning J, Li S, Chen W, Cheng F, Zhou X. Exosomal miR-21 from tubular cells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targeting PTEN in obstructed kidneys. Theranostics. 2021 Aug 2;11(18):8660-8673. doi: 10.7150/thno.62820.