外泌體lncRNA構(gòu)成調(diào)節(jié)環(huán)路驅(qū)動(dòng)膀胱癌的淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移

具有淋巴結(jié)（LN）的前列腺癌（BCa）患者的預(yù)后更差。BCa來源外泌體可作為循環(huán)生物活性載體以介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而觸發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究揭示了一個(gè)新的機(jī)制，即外泌體BCYRN1協(xié)同增強(qiáng)VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路誘導(dǎo)LN轉(zhuǎn)移。本文于2021年6月發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》 IF:11.492期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、外泌體BCYRN1與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

首先作者對(duì)患者的尿來源的外泌體進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)255個(gè)lncRNA上調(diào)表達(dá)，然后分析外泌體lncRNA與VEGF-C/VEGFR3信號(hào)激活的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BCYRN1，MAP4K3-DT和RP5-857K21.7與其顯著正相關(guān)，擴(kuò)大臨床樣本驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)只有BCYRN1在BCa患者尿液外泌體中高表達(dá)（圖1A-1D）。FISH和亞細(xì)胞定位顯示BCYRN1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。此外，臨床驗(yàn)證的結(jié)果顯示BCYRN1在BCa組織的表達(dá)顯著高于癌旁，在LN轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)水平顯著高于無LN轉(zhuǎn)移的，且其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（圖1G-1K）。免疫組化分析顯示淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1 (LYVE-1)陽(yáng)性信號(hào)的結(jié)果顯示，BCa組織瘤周和瘤內(nèi)區(qū)域BCYRN1表達(dá)與微淋巴管密度呈正相關(guān)（圖1M-1N）。以上說明外泌體BCYRN1促進(jìn)BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并與不良預(yù)后相關(guān)。

圖1外泌體BCYRN1過表達(dá)與BCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

2、BCYRN1在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中高表達(dá)

隨后，在體外檢測(cè)外泌體BCYRN1的表達(dá)模式，和體內(nèi)結(jié)果一致，與對(duì)照組細(xì)胞相比，BCYRN1在BCa細(xì)胞分泌的外泌體中高表達(dá)。BCYRN1過表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，過表達(dá)BCYRN1促進(jìn)HLECs的淋巴管生成和遷移，干擾BCYRN1的表達(dá)則相反。表明外泌體BCYRN1促進(jìn)體外BCa的惡性表型。

圖2外泌體BCYRN1促進(jìn)體外BCa的淋巴管生成

此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)外泌體BCYRN1顯著增強(qiáng)原癌腫瘤的LN轉(zhuǎn)移（圖3B-3C），并且增大了LN的轉(zhuǎn)移體積和比例（圖3D-3G）。 提示，外泌體BCYRN1促進(jìn)體內(nèi)BCa的LN轉(zhuǎn)移。

圖3外泌體BCYRN1在體內(nèi)增強(qiáng)BCa的LN轉(zhuǎn)移

3、BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

從lncRNA和蛋白相互作用的角度出發(fā)，作者使用pull-down實(shí)驗(yàn)鑒定了與BCYRN1相互作用的候選蛋白質(zhì)（圖4A-4C），然后使用WB證實(shí)BCYRN1與hnRNPA1之間存在相互作用（圖4D-4E）。共聚焦實(shí)驗(yàn)表明兩者存在共定位表達(dá)，RIP表明與對(duì)照相比，BCYRN1顯著富集于hnRNPA1探針中，這進(jìn)一步證實(shí)了兩者的結(jié)合關(guān)系。序列敲除后的WB表明BCYRN1與hnRNPA1的結(jié)合依賴50–100-nt區(qū)域，如圖4I所示區(qū)域?？傊?，BCYRN1通過50-100nt區(qū)域直接與hnRNPA1結(jié)合。

圖4 BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

4、BCYRN1上調(diào)WNT5A的表達(dá)通過與其啟動(dòng)子形成DNA-RNA復(fù)合物

鑒于許多證據(jù)表明lncRNA廣泛參與腫瘤進(jìn)展的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)，所以作者檢測(cè)了BCa細(xì)胞中過表達(dá)或沉默BCYRN1后終于信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示W(wǎng)NT5A是最顯著改變的基因，且其表達(dá)與BCYRN1表現(xiàn)出相關(guān)性（圖5A）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示包含有-500至-700bp的WNT5A啟動(dòng)子的片段可以顯著增加BCYRN1過表達(dá)細(xì)胞的熒光素酶活性（圖5B）。ChIRP實(shí)驗(yàn)顯示BCYRN1直接與WNT5A啟動(dòng)子的-661至671bp區(qū)域結(jié)合。FRET實(shí)驗(yàn)顯示與單鏈RNA/WNT5A TTS3對(duì)照組相比，在BCYRN1 TFO3/WNT5A TTS3組的信號(hào)強(qiáng)度在570-580nm出顯著增強(qiáng)，在520nm處顯著減弱（圖5E-5G）。

作者此前的研究證實(shí)hnRNPA1誘導(dǎo)的H3K4me3在基因表達(dá)中發(fā)揮了重要作用，所以作者猜測(cè)BCYRN1是否通過增加hnrnpa1誘導(dǎo)的WNT5A啟動(dòng)子上的H3K4me3來介導(dǎo)WNT5A的轉(zhuǎn)錄激活。ChIP-qPCR證實(shí)了該猜想，BCYRN1沉默顯著降低了WNT5A啟動(dòng)子中hnRNPA1和H3K4me3的富集程度，而BCYRN1過表達(dá)顯著增加了BCa中hnRNPA1和H3K4me3在WNT5A啟動(dòng)子中的富集（圖5H-5I）。因此，以上表明BCYRN1通過與WNT5A啟動(dòng)子結(jié)合，形成DNA-RNA結(jié)構(gòu)，招募hnRNPA1增加其H3K4me3水平，激活WNT5A轉(zhuǎn)錄。

5、BCYRN1激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)VEGF-C的分泌

隨后，作者發(fā)現(xiàn)沉默或過表達(dá)BCYRN1會(huì)相對(duì)應(yīng)的抑制或激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，如圖5J-5M所示，并且也會(huì)相對(duì)應(yīng)的減少或增加VEGF-C分泌，如圖5N-5Q。總之，BCYRN1能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)VEGF-C分泌。

圖5 BCYRN1表觀遺傳學(xué)上調(diào)WNT5A表達(dá)，激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)BCa細(xì)胞VEGF-C分泌

6、外泌體BCYRN1被HLECs內(nèi)化，促進(jìn)BCa的淋巴管生成

研究發(fā)現(xiàn)外泌體BCYRN1可以被HLECs內(nèi)化，過表達(dá)或沉默BCYRN1可以增加或減少受體HLECs中BCYRN1的表達(dá)（圖6A-6F）。隨后構(gòu)建了BCYRN1敲除的HLECs細(xì)胞系，然后在敲除組和野生組過表達(dá)BCYRN1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論敲除組還是對(duì)照組，過表達(dá)BCYRN1的外泌體處理都會(huì)顯著增加細(xì)胞tube的長(zhǎng)度，遷移數(shù)量，而敲除后沉默BCYRN1則相反（圖6G-6L）。這些結(jié)果表明，外泌體BCYRN1可以被HLECs內(nèi)化，進(jìn)而促進(jìn)BCa的淋巴管生成。

圖6外泌體BCYRN1被傳遞到HLECs促進(jìn)BCa的淋巴管生成

7、外泌體BCYRN1與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調(diào)節(jié)軸形成前饋回路

用BCYRN1沉默外泌體孵育HLECs后，其VEGFR3的表達(dá)顯著下降，過表達(dá)則相反（圖7A-7D）。生物素化寡核苷酸的RNA下拉實(shí)驗(yàn)表明，外泌體BCYRN1與VEGFR3的3 -UTR直接相互作用，而誘導(dǎo)VEGFR3的3 -UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)突變，則削弱了其與外泌體BCYRN1的相互作用（圖7F-7K）。由于與mRNA的3-UTR的相互作用是有助于細(xì)胞中的RNA穩(wěn)定性的一個(gè)共同特征，作者進(jìn)一步進(jìn)行放線菌素D檢測(cè)，揭示由BCYRN1沉默的BCa細(xì)胞分泌的外泌體顯著縮短了VEGFR3 mRNA的半衰期，而過表達(dá)BCYRN1的BCa細(xì)胞的外泌體延長(zhǎng)了VEGFR3 mRNA的半衰期（圖7L-7O）。提示外泌體BCYRN1促進(jìn)了HLECs中VEGFR3 mRNA的穩(wěn)定性。預(yù)測(cè)的BCYRN1的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7P所示，包含與VEGFR3的3’-UTR結(jié)合的一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。突變?cè)搮^(qū)域則顯著廢止了延長(zhǎng)VEGFR3 mRNA的半衰期的能力（圖7Q-7R）。總之，研究表明，外泌體BCYRN1通過與VEGFR3的3’ -UTR相互作用，促進(jìn)VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩(wěn)定性，從而構(gòu)成一個(gè)與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調(diào)節(jié)軸相連的前反饋回路。

圖7外泌體BCYRN1通過增強(qiáng)VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩(wěn)定性上調(diào)VEGFR3的表達(dá)

8、前饋環(huán)路誘導(dǎo)的VEGF-C/VEGFR3信號(hào)對(duì)于外泌體BCYRN1介導(dǎo)的LN轉(zhuǎn)移至關(guān)重要

接下來，作者探討了抑制前導(dǎo)環(huán)路誘導(dǎo)的VEGF-C/VEGFR3信號(hào)是否會(huì)減弱外泌體BCYRN1誘導(dǎo)BCa淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，與BCYRN1過表達(dá)BCa分泌外泌體孵育會(huì)促進(jìn)HLECs的成管和遷移，但是這被沉默VEGFR3所廢除（圖8A）。此外，作者引入了阻斷VEGFR3活性的抑制劑，SAR131675，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAR131675處理后，外泌體BCYRN1誘導(dǎo)的裸鼠淋巴結(jié)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)明顯受損（圖8B）。WNT5A和VEGFR3的表達(dá)在上述各處理下的變化模式也和上述一致（圖8C-8F），提示阻斷VEGFR3可抑制外泌體BCYRN1介導(dǎo)的BCa體內(nèi)淋巴管生成。此外，圖8G-8I的結(jié)果表明，BCYRN1外泌體與BCa患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明前導(dǎo)環(huán)路誘導(dǎo)的VEGF-C/VEGFR3信號(hào)通路對(duì)于BCYRN1介導(dǎo)的BCa淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移是必不可少的。

圖8前饋環(huán)路誘導(dǎo)的VEGF-C/VEGFR3信號(hào)對(duì)于BCa的外泌體BCYRN1介導(dǎo)的LN轉(zhuǎn)移至關(guān)重要

總之，如圖8J所示，該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了外泌體BCYRN1通過形成一個(gè)與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調(diào)節(jié)軸相關(guān)的前反饋回路在BCa淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移中的重要作用。外泌體BCYRN1通過VEGFC依賴方式介導(dǎo)BCa LN轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為外泌體lncRNA誘導(dǎo)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供了新的思路。靶向外泌體BCYRN1阻斷VEGF-C/VEGFR3信號(hào)的病理過度激活是一種很有前景的LN轉(zhuǎn)移性BCa患者的臨床干預(yù)手段。

參考文獻(xiàn)：

Zheng Hanhao., Chen Changhao., Luo Yuming., Yu Min., He Wang., An Mingjie., Gao Bowen., Kong Yao., Ya Yiyao., Lin Yan., Li Yuting., Xie Keji., Huang Jian., Lin Tianxin.(2021). Tumor-derived exosomal BCYRN1 activates WNT5A/VEGF-C/VEGFR3 feedforward loop to drive lymphatic metastasis of bladder cancer. Clin Transl Med, 11(7), e497. doi:10.1002/ctm2.497