外泌體lncRNA構成調節(jié)環(huán)路驅動膀胱癌的淋巴結節(jié)轉移

具有淋巴結（LN）的前列腺癌（BCa）患者的預后更差。BCa來源外泌體可作為循環(huán)生物活性載體以介導腫瘤微環(huán)境中的信號轉導進而觸發(fā)腫瘤轉移。本研究揭示了一個新的機制，即外泌體BCYRN1協(xié)同增強VEGF-C/VEGFR3信號通路誘導LN轉移。本文于2021年6月發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》 IF:11.492期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、外泌體BCYRN1與BCa淋巴結轉移相關

首先作者對患者的尿來源的外泌體進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)255個lncRNA上調表達，然后分析外泌體lncRNA與VEGF-C/VEGFR3信號激活的相關性，發(fā)現(xiàn)BCYRN1，MAP4K3-DT和RP5-857K21.7與其顯著正相關，擴大臨床樣本驗證后發(fā)現(xiàn)只有BCYRN1在BCa患者尿液外泌體中高表達（圖1A-1D）。FISH和亞細胞定位顯示BCYRN1主要存在于細胞質中。此外，臨床驗證的結果顯示BCYRN1在BCa組織的表達顯著高于癌旁，在LN轉移的腫瘤組織中表達水平顯著高于無LN轉移的，且其高表達與不良預后相關（圖1G-1K）。免疫組化分析顯示淋巴管內皮透明質酸受體1 (LYVE-1)陽性信號的結果顯示，BCa組織瘤周和瘤內區(qū)域BCYRN1表達與微淋巴管密度呈正相關（圖1M-1N）。以上說明外泌體BCYRN1促進BCa淋巴結轉移并與不良預后相關。

圖1外泌體BCYRN1過表達與BCa淋巴結轉移相關

2、BCYRN1在BCa細胞分泌的外泌體中高表達

隨后，在體外檢測外泌體BCYRN1的表達模式，和體內結果一致，與對照組細胞相比，BCYRN1在BCa細胞分泌的外泌體中高表達。BCYRN1過表達和干擾實驗的結果顯示，過表達BCYRN1促進HLECs的淋巴管生成和遷移，干擾BCYRN1的表達則相反。表明外泌體BCYRN1促進體外BCa的惡性表型。

圖2外泌體BCYRN1促進體外BCa的淋巴管生成

此外，體內實驗顯示，過表達外泌體BCYRN1顯著增強原癌腫瘤的LN轉移（圖3B-3C），并且增大了LN的轉移體積和比例（圖3D-3G）。 提示，外泌體BCYRN1促進體內BCa的LN轉移。

圖3外泌體BCYRN1在體內增強BCa的LN轉移

3、BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

從lncRNA和蛋白相互作用的角度出發(fā)，作者使用pull-down實驗鑒定了與BCYRN1相互作用的候選蛋白質（圖4A-4C），然后使用WB證實BCYRN1與hnRNPA1之間存在相互作用（圖4D-4E）。共聚焦實驗表明兩者存在共定位表達，RIP表明與對照相比，BCYRN1顯著富集于hnRNPA1探針中，這進一步證實了兩者的結合關系。序列敲除后的WB表明BCYRN1與hnRNPA1的結合依賴50–100-nt區(qū)域，如圖4I所示區(qū)域?？傊?，BCYRN1通過50-100nt區(qū)域直接與hnRNPA1結合。

圖4 BCYRN1直接與hnRNPA1相互作用

4、BCYRN1上調WNT5A的表達通過與其啟動子形成DNA-RNA復合物

鑒于許多證據(jù)表明lncRNA廣泛參與腫瘤進展的細胞內信號調節(jié)，所以作者檢測了BCa細胞中過表達或沉默BCYRN1后終于信號相關基因的表達變化。結果顯示W(wǎng)NT5A是最顯著改變的基因，且其表達與BCYRN1表現(xiàn)出相關性（圖5A）。熒光素酶實驗顯示包含有-500至-700bp的WNT5A啟動子的片段可以顯著增加BCYRN1過表達細胞的熒光素酶活性（圖5B）。ChIRP實驗顯示BCYRN1直接與WNT5A啟動子的-661至671bp區(qū)域結合。FRET實驗顯示與單鏈RNA/WNT5A TTS3對照組相比，在BCYRN1 TFO3/WNT5A TTS3組的信號強度在570-580nm出顯著增強，在520nm處顯著減弱（圖5E-5G）。

作者此前的研究證實hnRNPA1誘導的H3K4me3在基因表達中發(fā)揮了重要作用，所以作者猜測BCYRN1是否通過增加hnrnpa1誘導的WNT5A啟動子上的H3K4me3來介導WNT5A的轉錄激活。ChIP-qPCR證實了該猜想，BCYRN1沉默顯著降低了WNT5A啟動子中hnRNPA1和H3K4me3的富集程度，而BCYRN1過表達顯著增加了BCa中hnRNPA1和H3K4me3在WNT5A啟動子中的富集（圖5H-5I）。因此，以上表明BCYRN1通過與WNT5A啟動子結合，形成DNA-RNA結構，招募hnRNPA1增加其H3K4me3水平，激活WNT5A轉錄。

5、BCYRN1激活Wnt/β-catenin信號通路，促進VEGF-C的分泌

隨后，作者發(fā)現(xiàn)沉默或過表達BCYRN1會相對應的抑制或激活Wnt/β-catenin信號通路，如圖5J-5M所示，并且也會相對應的減少或增加VEGF-C分泌，如圖5N-5Q。總之，BCYRN1能激活Wnt/β-catenin信號通路促進VEGF-C分泌。

圖5 BCYRN1表觀遺傳學上調WNT5A表達，激活Wnt/β-catenin通路，促進BCa細胞VEGF-C分泌

6、外泌體BCYRN1被HLECs內化，促進BCa的淋巴管生成

研究發(fā)現(xiàn)外泌體BCYRN1可以被HLECs內化，過表達或沉默BCYRN1可以增加或減少受體HLECs中BCYRN1的表達（圖6A-6F）。隨后構建了BCYRN1敲除的HLECs細胞系，然后在敲除組和野生組過表達BCYRN1，結果發(fā)現(xiàn)無論敲除組還是對照組，過表達BCYRN1的外泌體處理都會顯著增加細胞tube的長度，遷移數(shù)量，而敲除后沉默BCYRN1則相反（圖6G-6L）。這些結果表明，外泌體BCYRN1可以被HLECs內化，進而促進BCa的淋巴管生成。

圖6外泌體BCYRN1被傳遞到HLECs促進BCa的淋巴管生成

7、外泌體BCYRN1與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節(jié)軸形成前饋回路

用BCYRN1沉默外泌體孵育HLECs后，其VEGFR3的表達顯著下降，過表達則相反（圖7A-7D）。生物素化寡核苷酸的RNA下拉實驗表明，外泌體BCYRN1與VEGFR3的3 -UTR直接相互作用，而誘導VEGFR3的3 -UTR的潛在結合位點突變，則削弱了其與外泌體BCYRN1的相互作用（圖7F-7K）。由于與mRNA的3-UTR的相互作用是有助于細胞中的RNA穩(wěn)定性的一個共同特征，作者進一步進行放線菌素D檢測，揭示由BCYRN1沉默的BCa細胞分泌的外泌體顯著縮短了VEGFR3 mRNA的半衰期，而過表達BCYRN1的BCa細胞的外泌體延長了VEGFR3 mRNA的半衰期（圖7L-7O）。提示外泌體BCYRN1促進了HLECs中VEGFR3 mRNA的穩(wěn)定性。預測的BCYRN1的二級結構如圖7P所示，包含與VEGFR3的3’-UTR結合的一個莖環(huán)結構。突變該區(qū)域則顯著廢止了延長VEGFR3 mRNA的半衰期的能力（圖7Q-7R）?？傊?，研究表明，外泌體BCYRN1通過與VEGFR3的3’ -UTR相互作用，促進VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩(wěn)定性，從而構成一個與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節(jié)軸相連的前反饋回路。

圖7外泌體BCYRN1通過增強VEGFR3 mRNA在HLECs中的穩(wěn)定性上調VEGFR3的表達

8、前饋環(huán)路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號對于外泌體BCYRN1介導的LN轉移至關重要

接下來，作者探討了抑制前導環(huán)路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號是否會減弱外泌體BCYRN1誘導BCa淋巴管生成和LN轉移的促進作用。挽救實驗結果如圖8所示，與BCYRN1過表達BCa分泌外泌體孵育會促進HLECs的成管和遷移，但是這被沉默VEGFR3所廢除（圖8A）。此外，作者引入了阻斷VEGFR3活性的抑制劑，SAR131675，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAR131675處理后，外泌體BCYRN1誘導的裸鼠淋巴結熒光強度增強明顯受損（圖8B）。WNT5A和VEGFR3的表達在上述各處理下的變化模式也和上述一致（圖8C-8F），提示阻斷VEGFR3可抑制外泌體BCYRN1介導的BCa體內淋巴管生成。此外，圖8G-8I的結果表明，BCYRN1外泌體與BCa患者淋巴結轉移顯著相關。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明前導環(huán)路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號通路對于BCYRN1介導的BCa淋巴管生成和LN轉移是必不可少的。

圖8前饋環(huán)路誘導的VEGF-C/VEGFR3信號對于BCa的外泌體BCYRN1介導的LN轉移至關重要

總之，如圖8J所示，該研究結果強調了外泌體BCYRN1通過形成一個與hnRNPA1/WNT5A/VEGFR3調節(jié)軸相關的前反饋回路在BCa淋巴管生成和LN轉移中的重要作用。外泌體BCYRN1通過VEGFC依賴方式介導BCa LN轉移的分子機制，為外泌體lncRNA誘導腫瘤淋巴轉移提供了新的思路。靶向外泌體BCYRN1阻斷VEGF-C/VEGFR3信號的病理過度激活是一種很有前景的LN轉移性BCa患者的臨床干預手段。

參考文獻：

Zheng Hanhao., Chen Changhao., Luo Yuming., Yu Min., He Wang., An Mingjie., Gao Bowen., Kong Yao., Ya Yiyao., Lin Yan., Li Yuting., Xie Keji., Huang Jian., Lin Tianxin.(2021). Tumor-derived exosomal BCYRN1 activates WNT5A/VEGF-C/VEGFR3 feedforward loop to drive lymphatic metastasis of bladder cancer. Clin Transl Med, 11(7), e497. doi:10.1002/ctm2.497