組蛋白去甲基化酶JMJD1C通過促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化預(yù)防膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤被認(rèn)為是一種侵襲性致死的原發(fā)性腦腫瘤。JMJD1C是一種H3K9去甲基化酶，參與各種腫瘤的進(jìn)展，但其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的具體功能和潛在機(jī)制尚不明確。2021年9月發(fā)表于Clinical and Translational Medicine（IF=11.492）的文章“Histone demethylase JMJD1C promotes the polarization of M1 macrophages to prevent glioma by upregulating miR-302a”對此進(jìn)行了介紹。在本文中，我們發(fā)現(xiàn)JMJD1C在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)較差。此外，JMJD1C通過促進(jìn)miR-302a啟動子區(qū)域的H3K9me1去甲基化而增加了miR-302a的表達(dá)。miR-302a可靶向METTL3，METTL3可通過m6A修飾抑制SOCS2表達(dá)。在體內(nèi)和體外，JMJD1C通過miR-302a/ METTTL3 /SOCS2軸促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，抑制異種膠質(zhì)瘤生長。這為JMJD1C在膠質(zhì)瘤病理生物學(xué)中的作用提供了新的視角，可能為靶向治療方法的研究提供了思路。

結(jié)果

1）JMJD1C在膠質(zhì)瘤中下調(diào)并與免疫反應(yīng)相關(guān)

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤樣本中JMJT1C的表達(dá)呈下降趨勢。通過RT-qPCR和IHC檢測，與相鄰正常組織相比，膠質(zhì)瘤組織中JMJD1C表達(dá)較差(圖1A,B)。同時，RT-qPCR顯示U251、LN-229和LN-18細(xì)胞中JMJD1C水平較HEB細(xì)胞低(圖1C)。我們采用高通量測序技術(shù)，在GBM LN-229細(xì)胞系中沉默JMJD1C后，研究基因的總體表達(dá)模式。JMJD1C的沉默改變了JMJD1C靶基因的表達(dá)。KEGG通路富集分析顯示，JMJD1C相關(guān)基因在腫瘤壞死因子(TNF)信號通路和免疫應(yīng)答過程的元件中富集(圖1D,E)，提示JMJD1C可能在LN-229細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。隨后，在LN-229和U251細(xì)胞株中檢測免疫和炎癥相關(guān)基因水平，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)JMJD1C可導(dǎo)致LN-229細(xì)胞中TGFβ 1-3表達(dá)降低，IL -1β和IL-6表達(dá)升高(圖1F,G)。因此，JMJD1C參與GBM的免疫應(yīng)答。

2）JMJD1C在體內(nèi)促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，抑制膠質(zhì)瘤

通過EdU染色和CCK-8法對穩(wěn)定過表達(dá)JMJD1C的LN-229和U251細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖篩選，結(jié)果顯示JMJD1C過表達(dá)對體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖有作用(圖2A,B)。然后，通過皮下注射表達(dá)OE-NC或OE-JMJD1C的LN-229細(xì)胞構(gòu)建腫瘤小鼠模型。我們觀察到過表達(dá)JMJD1C可抑制腫瘤的生長(圖2C-E)。IHC和TUNEL檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)JMJD1C誘導(dǎo)的TUNEL陽性細(xì)胞更多，Ki67陽性細(xì)胞更少(圖2F)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD86和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206，結(jié)果顯示JMJD1C過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤組織中CD206+細(xì)胞減少，CD86+細(xì)胞增多(圖2G)。RT-qPCR表明，相對于OE-NC，在OEJMJD1C處理的小鼠中M1標(biāo)記IL-1β，TNF，CXCL9，IL-23，ROS1，IL-12和IL-12b水平增加，而M2標(biāo)記TGFB1，VEGFA，EGF，IL-6，IL-10，ARG1，RETNLA 和CCL22減少(圖2 h, I)。這些結(jié)果提示，JMJD1C本身并不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，但能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長，這可能與M1巨噬細(xì)胞極化增強(qiáng)、M2巨噬細(xì)胞極化減弱有關(guān)。

3）特異性表達(dá)JMJD1C可加速M1巨噬細(xì)胞的極化

免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染OE-JMJD1C質(zhì)粒的LN-229和U251細(xì)胞系中JMJD1C的表達(dá)情況(圖3A,B)。其次，根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞的E/T比值，CD86+ M1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)與CD14 + PBMCs有區(qū)別，E/T比為50:1的共培養(yǎng)誘導(dǎo)效果最佳(圖3C,D)。共培養(yǎng)實驗顯示，JMJD1C升高增加了LN-229和U251細(xì)胞中單核細(xì)胞分化的CD86+M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖3E,F)。此外，RT-qPCR結(jié)果顯示，在CD14+PBMCs中，上調(diào)JMJD1C可促進(jìn)M1標(biāo)記基因的表達(dá)，抑制M2標(biāo)記基因的表達(dá)(圖3G,H)。因此，JMJD1C過表達(dá)有可能使巨噬細(xì)胞向M1表型極化。

4）JMJD1C通過促進(jìn)miR-302a啟動子區(qū)H3K9去甲基化上調(diào)miR-302a

根據(jù)既往文獻(xiàn)，我們推測JMJD1C可能通過調(diào)節(jié)miR-302a影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。正如預(yù)期的那樣，RT-qPCR和原位雜交結(jié)果表明，miR-302a下調(diào)發(fā)生在膠質(zhì)瘤組織中(圖4A,B)。同時，miR-302a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平也降低(圖4C)。而在JMJD1C過表達(dá)的LN-229細(xì)胞中miR-302a水平升高，在JMJD1C沉默的細(xì)胞中miR-302a水平顯著降低(圖4D)。然后，我們發(fā)現(xiàn)，通過ChIP檢測，在OE-JMJD1C處理的細(xì)胞中，JMJD1C的富集程度(圖4E)高于OENC處理的細(xì)胞。過表達(dá)JMJD1C后H3K9me1水平降低(圖4F)，說明JMJD1C可能通過H3K9去甲基化促進(jìn)miR-302a的表達(dá)。

5）miR-302a靶向METTL3

正如生物信息學(xué)網(wǎng)站所預(yù)測的，miR-302a與METTTL3 3'UTR之間的靶向結(jié)合位點(diǎn)被鑒定出來(圖5A)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果驗證了靶向性(圖5B)。使用生物素標(biāo)記的miR-302a探針進(jìn)行RNA下拉實驗，進(jìn)一步證實了miR-302a和METTL3之間的相互作用(圖5C)。RT-qPCR結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測LN-229細(xì)胞中miR-302a過表達(dá)或耗盡后METTTL3的表達(dá)變化(圖5E,F)。通過RT-qPCR驗證過表達(dá)和耗盡的效率(圖5D)。在miR-302a模擬處理的細(xì)胞中，METTL3的表達(dá)減少，而在miR-302a抑制物處理的細(xì)胞中，METTL3的表達(dá)增加。這些結(jié)果一致表明miR-302a靶向METTTL3。

6）METTTL3通過降解m6A修飾誘導(dǎo)的SOCS2 mRNA抑制M1巨噬細(xì)胞極化

我們還研究了mRNA甲基化酶METTTL3對膠質(zhì)瘤細(xì)胞SOCS2表達(dá)的影響。根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫，GBM組織中SOCS2相對于正常組織有升高(圖6A)。RT-qPCR檢測的臨床樣本中SOCS2 mRNA水平在膠質(zhì)瘤組織中呈上升趨勢(圖6B)。SOCS2蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)也增加(圖6C)。隨后，在LN-229細(xì)胞中過表達(dá)或沉默METTL3，發(fā)現(xiàn)這抑制了SOCS2 mRNA和蛋白的表達(dá)，而沉默METTL3則導(dǎo)致相反的結(jié)果(圖6D,E)。考慮到METTTL3是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，采用MeRIP-RTqPCR分析過表達(dá)METTTL3的LN-229細(xì)胞中SOCS2的m6A水平，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)METTTL3時SOCS2的甲基化水平升高(圖6F)。以上結(jié)果表明，METTTL3通過促進(jìn)SOCS2的m6A甲基化修飾來促進(jìn)膠質(zhì)瘤中SOCS2的降解。另外，METTL3過表達(dá)導(dǎo)致SOCS2表達(dá)受到抑制，而METTL3與SOCS2共轉(zhuǎn)染促進(jìn)SOCS2表達(dá)(圖6G)。人類CD14+單核細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)顯示，過表達(dá)METTL3減少CD86 + M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量，而同時過表達(dá)METTL3和SOCS2使CD86 + M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加(圖6 h,I)。此外，過表達(dá)METTTL3導(dǎo)致M1標(biāo)記表達(dá)被抑制，M2標(biāo)記表達(dá)升高，而與SOCS2共轉(zhuǎn)染促進(jìn)M1標(biāo)記基因表達(dá)，抑制M2標(biāo)記基因表達(dá)(圖6J)。以上數(shù)據(jù)表明METTTL3可能通過誘導(dǎo)SOCS2 mRNA的降解來促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化。

7）JMJD1C通過miR-302a/METTTL3/SOCS2誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞極化預(yù)防膠質(zhì)瘤

為了驗證JMJD1C是否通過miR-302a/METTTL3/SOCS2軸促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的極化從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展，我們獲得了穩(wěn)定過表達(dá)JMJD1C或與SOCS2沉默共同過表達(dá)的LN-229細(xì)胞，然后接種裸鼠。JMJD1C過表達(dá)抑制了腫瘤的生長，但加入sh-SOCS2治療后這種作用被逆轉(zhuǎn)(圖7A-C)。OE-JMJD1C處理后，JMJD1C、miR-302a和SOCS2表達(dá)升高，METTTL3表達(dá)降低，而OE-JMJD1C和sh-SOCS2處理后SOCS2水平降低，但JMJD1C、miR-302a和METTTL3表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)變化(圖7D,E)。IHC和TUNEL檢測顯示，OE-JMJD1C處理后，TUNEL陽性細(xì)胞增多，ki67陽性細(xì)胞減少，而sh-SOCS2進(jìn)一步處理后，這一趨勢被逆轉(zhuǎn)(圖7F)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示OE-JMJD1C中CD206+細(xì)胞百分率降低，CD86+細(xì)胞百分率增加，而sh-SOCS2進(jìn)一步處理則相反(圖7G)。同時，OE-JMJD1C中IL-1β、TNF、CXCL9、IL-23、ROS1、IL-12a和IL-12b上調(diào)，而TGFB1、VEGFA、EGF、IL-6、IL-10、ARG1、RETNLA和CCL22下調(diào)，而sh-SOCS2的進(jìn)一步處理消除了這一趨勢(圖7H,I)。綜上所述，JMJD1C通過miR-302a/METTTL3/SOCS2軸促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞極化，抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

結(jié)論：JMJD1C通過上調(diào)miR-302a，進(jìn)一步影響M1巨噬細(xì)胞METTL3/SOCS2介導(dǎo)的極化，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑瘤作用。未來的研究需要進(jìn)一步探索JMJD1C作為膠質(zhì)瘤預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物的可能性。

參考文獻(xiàn)：Zhong C, Tao B, Yang F, Xia K, Yang X, Chen L, Peng T, Xia X, Li X, Peng L. Histone demethylase JMJD1C promotes the polarization of M1 macrophages to prevent glioma by upregulating miR-302a. Clin Transl Med. 2021 Sep;11(9):e424. doi: 10.1002/ctm2.424. PMID: 34586733; PMCID: PMC8473479.