Lnc-DC促進(jìn)乳腺癌中雌激素獨(dú)立生長(zhǎng)和它莫西芬耐藥

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-11-18
目前,有研究對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)是否參與ER陽性乳腺癌中雌激素獨(dú)立生長(zhǎng)和他莫西芬耐藥的調(diào)控進(jìn)行了研究,該研究于......


選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)如他莫昔芬已被證明對(duì)雌激素受體(ER)陽性乳腺癌有效。然而,這種內(nèi)分泌治療的主要障礙是雌激素獨(dú)立生長(zhǎng),導(dǎo)致耐藥性,其潛在機(jī)制尚不完全清楚。目前,有研究對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)是否參與ER陽性乳腺癌中雌激素獨(dú)立生長(zhǎng)和他莫西芬耐藥的調(diào)控進(jìn)行了研究,該研究于202110月發(fā)表在《Cell Death & Disease》,IF:8.469。


主要技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:

1. Lnc-DC被鑒定為參與雌激素獨(dú)立生長(zhǎng)的潛在lncRNA;它的上調(diào)與乳腺癌患者的生存和他莫西芬反應(yīng)有關(guān)。

作者首先對(duì)參與雌激素非依賴性生長(zhǎng)的lncRNA進(jìn)行功能篩選。使用圖中概述的選擇程序圖1A,發(fā)現(xiàn)在雌激素剝奪28天后,用于載體控制的存活細(xì)胞很少,而用于SAM gRNA文庫的存活細(xì)胞更多,這表明可以促進(jìn)細(xì)胞在無E2培養(yǎng)基中存活的SAM gRNA被富集。由于雌激素非依賴性常常導(dǎo)致三苯氧胺抵抗,因此這個(gè)過程是否會(huì)影響這些細(xì)胞對(duì)三苯氧胺的反應(yīng)。正如所料,選擇后(As)細(xì)胞比選擇前(BS)細(xì)胞對(duì)他莫昔芬更具耐藥性(1B)。與這些結(jié)果一致的是,TUNEL檢測(cè)顯示,AS細(xì)胞在三苯氧胺作用下的凋亡率(~8%)遠(yuǎn)低于BS細(xì)胞(~20%)(1C)。接下來,將BS細(xì)胞或AS細(xì)胞注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪墊中,以確定它們是否可以在不補(bǔ)充雌激素的情況下生長(zhǎng)成腫瘤。正如預(yù)期的那樣,添加E2(雌二醇顆粒)的親代MCF-7導(dǎo)致100%的腫瘤發(fā)生率(1D)。不含E2BS細(xì)胞腫瘤率為17%;相比之下,不含E2AS細(xì)胞腫瘤攝取率為35%(1D),進(jìn)一步表明lncRNA參與促進(jìn)雌激素獨(dú)立生長(zhǎng)。為了確定哪些SAM gRNAs被這種選擇富集,作者采用了兩步方法。第一步是對(duì)該文庫中的每個(gè)lncRNA進(jìn)行qRT-PCR序列分析。第二步是利用gRNA特異性引物集,通過qRT-PCR檢測(cè)SAM gRNA的相對(duì)豐度,重點(diǎn)檢測(cè)雌激素剝奪后富集的SAM gRNA。lncRNA分析發(fā)現(xiàn),與選擇前(BS)相比,選擇后(AS)3個(gè)lncRNA (C1qTNF9B-AS1, Lnc-DCMEG3)表達(dá)上調(diào)(1E)?;谌橄侔┗蛐酒瑪?shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)Lnc-DCMEG3都在數(shù)據(jù)庫中。有趣的是,在1764例乳腺癌病例中,Lnc-DC上調(diào)與無復(fù)發(fā)生存期(RFS)較差相關(guān),Logrank4.6e-0.5, HR = 1.39(1F)。高Lnc-DC水平與低RFS相關(guān),Logrank0.01,HR = 4.4(1G)。該分析也支持了Lnc-DC水平高的患者對(duì)他莫昔芬反應(yīng)較差的觀點(diǎn)(1H),提示了Lnc-DC的臨床重要性。因此,我們進(jìn)一步對(duì)Lnc-DC進(jìn)行了表征,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1 Lnc-DC作為一種潛在的lncRNA參與雌激素獨(dú)立和他莫西芬耐藥。


2. Lnc-DC
促進(jìn)他莫昔芬耐藥

為了證實(shí)Lnc-DC gRNA對(duì)上調(diào)Lnc-DC表達(dá)的作用,從gRNA區(qū)域和支架區(qū)域設(shè)計(jì)了引物來檢測(cè)外源性的Lnc-DC gRNA水平。雖然該SAM文庫中包含5種不同的Lnc-DC gRNA,但選擇后只有Lnc-DC gRNA 1 (Lnc-DC1)高度富集(2A)。另外,只有LncDC1能夠激活內(nèi)源性的Lnc-DC表達(dá)(2B),這表明雖然不是所有的gRNA都能誘導(dǎo)內(nèi)源性基因表達(dá),但那些能夠誘導(dǎo)內(nèi)源性基因表達(dá)的gRNA可以通過雌激素剝奪等選擇手段富集。接下來,作者確定了Lnc-DC對(duì)他莫昔芬耐藥的貢獻(xiàn)。用它莫西芬處理Lnc-DC1細(xì)胞和載體對(duì)照細(xì)胞。如圖2C所示,Lnc-DC1細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的抗性是載體對(duì)照細(xì)胞的3倍。同樣,Lnc-DC1導(dǎo)致的凋亡率低于載體對(duì)照(2D)。此外,Lnc-DC1細(xì)胞顯示Bcl2Bcl-xL水平升高(2E),這可能是觀察到的對(duì)他莫昔芬耐藥的部分原因。Lnc-DC也降低了PARPCaspase 3的裂解水平(2F)。通過TUNEL實(shí)驗(yàn)可以明顯看出,Lnc-DC KO細(xì)胞對(duì)他莫昔芬更敏感(3A)。然后,作者選擇了兩個(gè)單一的Lnc-DC KO克隆,同時(shí)納入了另一個(gè)ER陽性乳腺癌細(xì)胞系T47D(S4)。菌落形成分析顯示,在MCF-7細(xì)胞中,兩個(gè)Lnc-DC KO克隆對(duì)他莫昔芬更敏感(3B)。例如,MCF-7 Lnc-DC KOIC5011.6 (KO#17)12.92 (KO#66),而病媒控制(IC5021.3)。與載體對(duì)照相比,Lnc-DC KO T47D細(xì)胞對(duì)他莫昔芬也更敏感(3C)。為了進(jìn)一步確定Lnc-DC在他莫昔芬耐藥中的作用,作者進(jìn)行了搶救實(shí)驗(yàn)。在MCF-7T47D細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)Lnc-DC KO增加了對(duì)他莫昔芬的敏感性;相比之下,在KO細(xì)胞中Lnc-DC的重新表達(dá)恢復(fù)了作為載體對(duì)照的他莫昔芬應(yīng)答(3D, E)。總之,這些結(jié)果支持了LncDC在他莫昔芬耐藥中的作用。

2 Lnc-DC促進(jìn)他莫昔芬耐藥

3Lnc-DC KO法和搶救法測(cè)定Lnc-DC介導(dǎo)的他莫昔芬耐藥性。


3. Lnc-DC
促進(jìn)STAT3磷酸化

為了確定Lnc-DC如何促進(jìn)他莫昔芬耐藥,作者檢測(cè)了這些細(xì)胞中STAT3的磷酸化。首先在選擇前檢測(cè)了攜帶SAM gRNA庫的細(xì)胞中STAT3的磷酸化,發(fā)現(xiàn)載體細(xì)胞和庫細(xì)胞之間沒有差異(4A)。然而,在選擇后,庫細(xì)胞比BS細(xì)胞顯示更高水平的磷酸化STAT3(4B)。為了確定Lnc-DCSTAT3激活中的作用,作者過表達(dá)了Lnc-DC,發(fā)現(xiàn)LncDC1能夠增加pSTAT3Y705在正常和E2游離培養(yǎng)基中的水平(4C)。此外,Lnc-DC KO導(dǎo)致pSTAT3Y705水平下降(4D)。STAT3抗體RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Lnc-DCSTAT3相互作用(4E)。此外,在S1m-LNC-DC沉淀中檢測(cè)到一個(gè)STAT3帶。這些結(jié)果有力地支持了Lnc-DCSTAT3之間的相互作用是特定的。為了確定Lnc-DC如何影響STAT3活性,作者發(fā)現(xiàn)雌激素剝奪降低了STAT3SHP-1的相互作用(4G), SHP-1是一種參與調(diào)控STAT3活性的磷酸酶。重要的是,Lnc-DC降低了SHP-1STAT3之間的相互作用(4H),這可能部分解釋了當(dāng)Lnc-DC水平升高時(shí),STAT3活性升高的原因。

4 Lnc-DC通過與STAT3相互作用促進(jìn)STAT3活性


4.
他莫昔芬耐藥AS細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子激活STAT3

與載體對(duì)照相比,在AS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中觀察到pSTAT3Y705的明顯激活(5A),表明細(xì)胞因子分泌到培養(yǎng)基中,能夠激活相鄰細(xì)胞的STAT3。為了確定從AS細(xì)胞培養(yǎng)中分泌的細(xì)胞因子,通過攜帶102種細(xì)胞因子抗體的細(xì)胞因子陣列從條件培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞因子分析。事實(shí)上,有一組11種細(xì)胞因子在AS細(xì)胞來源的培養(yǎng)基中比在載體對(duì)照細(xì)胞中更高(5B)。qRT-PCR分析驗(yàn)證了其中5個(gè)(GDF15、IGFBP-2 PDFG-ACXCL12VEGF)(5C為綠色),與載體對(duì)照相比,它們?cè)?/span>AS細(xì)胞中也上調(diào)(5D)qRT-PCR分析顯示,這5個(gè)細(xì)胞因子基因中有4個(gè)在STAT3 KD細(xì)胞中明顯下調(diào)(5E)。特別是GDF15的抑制最為明顯。最后,與對(duì)照組相比,用GDF15、IGFBP-2VEGF處理MCF-7細(xì)胞可增強(qiáng)pSTAT3Y705的磷酸化(5F)。這些結(jié)果提示STAT3和細(xì)胞因子存在一個(gè)正反饋回路,它們共同促進(jìn)他莫昔芬耐藥。

5 STAT3介導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生


5. Lnc-DC
通過STAT3促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生

通過qRT-PCR證實(shí)了Lnc-DC1細(xì)胞中三個(gè)細(xì)胞因子基因中的兩個(gè)被轉(zhuǎn)錄激活(6A)。還發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)水平升高(6B)。此外,在Lnc-DC細(xì)胞中通過siRNA下調(diào)STAT3,發(fā)現(xiàn)STAT3 KD能夠抑制GDF15IGFBP2(6C)。此外,Lnc-DC KO下調(diào)GDF15 mRNA水平(6D)和蛋白水平(6E)。特別是, GDF15GDF15轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約600 bp處攜帶一個(gè)典型的STAT3結(jié)合位點(diǎn)(6F)。STAT3抗體ChIP分析證實(shí)STAT3GDF15啟動(dòng)子相互作用(6F)。針對(duì)GDF15啟動(dòng)子的PCR引物僅在STAT3抗體通道中檢測(cè)到一條獨(dú)特的PCR帶,而IgGKu80抗體(陰性對(duì)照)通道中檢測(cè)不到。總之,這些結(jié)果表明,在Lnc-DC起關(guān)鍵作用的地方存在STAT3-細(xì)胞因子循環(huán)。結(jié)果,這些細(xì)胞變得獨(dú)立于雌激素,并對(duì)它莫西芬產(chǎn)生抗藥性(6G)

6 Lnc-DC促進(jìn)細(xì)胞因子基因的表達(dá)


主要結(jié)論:

綜上所述,作者證明了Lnc-DCSTAT3細(xì)胞因子環(huán)路的調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,導(dǎo)致雌激素獨(dú)立和他莫西芬耐藥。此外,臨床數(shù)據(jù)挖掘表明,Lnc-DC可能作為預(yù)測(cè)他莫昔芬反應(yīng)的潛在標(biāo)志物。在這個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)中,JAK促進(jìn)STAT3磷酸化,而SHP-1促進(jìn)去磷酸化。Lnc-DCSTAT3的相互作用可能阻止SHP-1對(duì)pSTAT3的作用,保持較高的pSTAT3水平。STAT3已知能夠上調(diào)抗凋亡基因,并刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生。由于CXCL12、IGFBP2GDF15等細(xì)胞因子可同時(shí)受ERSTAT3調(diào)控,可以想象這些細(xì)胞因子除了抗凋亡基因外,可以在升高的Lnc-DC背景下持續(xù)產(chǎn)生,即使通過雌激素剝奪或三苯氧胺治療等臨床干預(yù)手段關(guān)閉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào),這些腫瘤細(xì)胞仍能存活和生長(zhǎng)。該研究為臨床研究他莫昔芬耐藥提供新的思路。