LncRNA MELTF-AS1調(diào)節(jié)MMP14的表達促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移

骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥，常見于兒童和青少年。對于轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤仍然缺乏有效的治療方法。本研究報道了一種新的lncRNA在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，其有作為靶向治療的潛在靶點。本文發(fā)表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》IF：8.886的2021年12月刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調(diào)，并與骨肉瘤的遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)

如圖1所示，作者分析TARGET數(shù)據(jù)庫骨肉瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了轉(zhuǎn)移組織和非轉(zhuǎn)移腫瘤組織的差異表達lncRNA，此外，MELTF-AS1的表達，與正常組織相比，在腫瘤中高表達；與非轉(zhuǎn)移的腫瘤組織相比，在遠端轉(zhuǎn)移組織中高表達；MELTF-AS1高表達和不良預(yù)后相關(guān)；它同時在多個骨肉瘤細胞系中高表達，但是在尤文氏肉瘤細胞系中卻沒有高表達，表明其特異性。

圖1 lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上調(diào)并與骨肉瘤的遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)

2、RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄

隨后作者為何MELTF-AS1的表達在骨肉瘤中升高。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測了可能與MELTF-AS1啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，其中RREB1的預(yù)測得分最高，而沉默RREB1之后，MELTF-AS1的表達顯著減少，過表達則相反（圖2A-B）。此外，RREB1的表達在遠端轉(zhuǎn)移組織中最高，其次是未轉(zhuǎn)移腫瘤，最后是正常組織，免疫組化可以清晰展示這一點（圖2C-D）。RREB1抗體的染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗表明，它可以直接結(jié)合MELTF-AS1的啟動子區(qū)域（圖2E）。熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎?dāng)RREB1過表達是，熒光素酶活性顯著增加，但是當(dāng)RREB1和啟動子結(jié)合區(qū)域敲除后，過表達RREB1也不能改變熒光素酶活性（圖2F）。這些表明RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄。

圖2 RREB1結(jié)合MELTF-AS1的啟動子激活其轉(zhuǎn)錄

3、MELTF-AS1促進骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

如圖3所示，干擾MELTF-AS1的表達，抑制骨肉瘤細胞的體外轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少，轉(zhuǎn)移標(biāo)志物表達下降，且敲除MELTF-AS1后小鼠的總體生存率顯著提高。這些結(jié)果表明MELTF-AS1可促進骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。

圖3 敲除MELTF-AS1抑制骨肉瘤的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

4、MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機制調(diào)控miR-485-5p

FISH和亞細胞分離的qRT-PCR分析結(jié)果顯示MELTF-AS1主要定位在細胞質(zhì)中（圖4A-B），因此，推測其可能作為ceRNA發(fā)揮功能，預(yù)測了可能具有潛在結(jié)合關(guān)系的miRNA并進行生物素標(biāo)記MELTF-AS1探針的RNA pull-down實驗。結(jié)果如圖4C所示，miR-485-5p和miR-665可以與MELTF-AS1直接結(jié)合，但因為前者的結(jié)合豐度更高，所以選擇miR-485-5p進行實驗。如預(yù)期地，沉默MELTF-AS1后miR-485-5p的表達顯著升高，過表達則相反（圖4D-E），RNA IP結(jié)果顯示MELTF-AS1和miR-485-5p都可以和AGO2蛋白直接結(jié)合，并且熒光素酶實驗的結(jié)果也表明兩者具有直接結(jié)合關(guān)系（圖4F-G）。此外，miR-485-5p在骨肉瘤組織中的表達與MELTF-AS1完全相反，和正常組織相比，在非轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中下調(diào)表達，在遠端轉(zhuǎn)移的組織中進一步顯著下調(diào)表達。以上結(jié)果表明MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA機制調(diào)控miR-485-5p。

圖4 miR-485-5p是MELTF-AS1的一個靶點

5、MELTF-AS1通過與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP14是miR-485-5p的一個靶基因，熒光素酶實驗證實兩者間具有直接結(jié)合關(guān)系（圖5A）。而沉默MELTF-AS1會顯著下調(diào)MMP14的表達，而當(dāng)MELTF-AS1沉默和miR-485-5p的抑制劑共同作用時MMP14的表達回復(fù)到接近正常水平（圖5B）。此外，過表達MELTF-AS1會導(dǎo)致MMP14的表達升高，但是與miR-485-5p同時過表達，則MMP14表達升高的趨勢被抑制（圖5C-D）。進一步分析發(fā)現(xiàn)MMP14的表達和MELTF-AS1的表達正相關(guān)，和miR-485-5p的表達負相關(guān)?？傊?，MELTF-AS1吸附細胞質(zhì)中miR-485-5p的表達，以ceRNA機制促進MMP14表達。

圖5 MELTF-AS1通過與miR-485-5p的相互作用調(diào)控MMP14的表達

6、MELTF-AS1通過調(diào)節(jié)MMP14促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移

如圖6所示，過表達MELTF-AS1增加了骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移和遷徙，和轉(zhuǎn)移標(biāo)志物分子的表達，但是在過表達MELTF-AS1的同時，過表達miR-485-5p或者抑制MMP14的表達，則顯著減少了這種轉(zhuǎn)移能力的能加。表明MELTF-AS1是通過調(diào)節(jié)MMP14促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移。

圖6 MELTF-AS1表現(xiàn)出部分依賴于MMP14的促轉(zhuǎn)移特性

總之，如圖7所示，轉(zhuǎn)錄因子RREB1激活MELTF-AS1的轉(zhuǎn)錄，其海綿吸附miR-485-5p進而上調(diào)靶基因MMP14的表達，導(dǎo)致骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的獲得。

圖7 本研究的機制模型圖

參考文獻：

Ding Lei., Liu Taiyuan., Qu Yuan., Kang Zhichen., Guo Lixin., Zhang Haina., Jiang Junjie., Qu Fuling., Ge Wanbao., Zhang Shanyong.(2021). lncRNA MELTF-AS1 facilitates osteosarcoma metastasis by modulating MMP14 expression. Mol Ther Nucleic Acids, 26(undefined), 787-797. doi:10.1016/j.omtn.2021.08.022