m6A修飾通過肝星狀細(xì)胞自噬信號通路調(diào)控鐵死亡

肝纖維化是一種復(fù)雜的生理和病理生理狀況，與瘢痕形成機(jī)制有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是肝纖維化的核心事件，肌成纖維細(xì)胞基質(zhì)主要由活化的 HSC 產(chǎn)生。今天我們來講一篇關(guān)于m6A修飾調(diào)控鐵死亡的文章，文章題名為：N6-methyladenosine modification regulates ferroptosis through autophagysignaling pathway in hepatic stellate cells，發(fā)表于Redox Biology期刊（IF=11.79）

m6A 修飾在HSC鐵死亡期間上調(diào)

Erastin、Sorafenib和RSL3處理明顯抑制了大鼠 (HSC-T6)、人 (HSC-LX2) HSC細(xì)胞，但鐵死亡抑制劑（ferrostatin- 1) 而不是壞死性凋亡抑制劑 (necrostatin-1) 和凋亡抑制劑 (ZVAD-FMK) 完全挽救了細(xì)胞生長抑制。erastin、Sorafenib 和RSL3 治療還顯著顯著增加了細(xì)胞內(nèi)MDA和鐵水平，降低了谷胱甘肽水平和脂質(zhì)ROS積累。是ferrostain-1，而不是 necrostatin-1 和 ZVAD-FMK，削弱了HSC 鐵死亡?？偟膩碚f，這些結(jié)果充分證實(shí)了erastin、sorafenib和RSL3可以在體外觸發(fā)HSC ferroptosis。

m6A RNA甲基化定量測定和斑點(diǎn)印跡顯示，在用Sorafenib、erastin 和 RSL3 處理后，HSC細(xì)胞m6A 修飾水平顯著增加。與其他甲基轉(zhuǎn)移酶相比，METTL4 的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。FTO在HSC鐵死亡中顯著下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明m6A修飾增加是由于HSC鐵死亡期間METTL4和FTO的失調(diào)。

抑制m6A修飾賦予HSC鐵死亡的抗性

m6A RNA甲基化定量分析證實(shí)，METTL4敲低和FTO過表達(dá)都可以降低Erastin誘導(dǎo)的HSC-LX2中m6A修飾的上調(diào)。METTL4敲低和FTO過表達(dá)顯著消除了erastin和sorafenib處理對HSC-LX2和HSC-T6細(xì)胞的生長抑制。METTL4敲低和FTO過表達(dá)明顯破壞了erastin和sorafenib誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鐵、MDA和ROS水平，提升了谷胱甘肽水平。在FTO過表達(dá)條件下，liproxstatin-1和ferrostain-1 在內(nèi)的鐵死亡抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了erastin 誘導(dǎo)的生長抑制。透射電子顯微鏡分析證實(shí)，erastin 處理大大減少了線粒體并減少了脊的數(shù)量，而 FTO 質(zhì)粒完全消除了鐵死亡細(xì)胞的典型變化。這些數(shù)據(jù)表明，鐵死亡誘導(dǎo)劑處理對m6A修飾的上調(diào)可能有助于 HSC 鐵死亡，但不會導(dǎo)致壞死性凋亡和細(xì)胞凋亡。

通過m6A修飾抑制減少鐵死亡與自噬失活有關(guān)

進(jìn)行了 RNA 測序 (RNA-seq)，以進(jìn)一步探索m6A修飾促進(jìn) HSC 鐵死亡的分子機(jī)制。在 FTO 過表達(dá)的HSC-LX2細(xì)胞中，424個(gè)mRNA顯著增加，而317個(gè) mRNAs明顯減少。這其中包含一些鐵死亡相關(guān)基因，例如 SLC7A11、SLC3A2、GPX4。KEGG)分析和 GO 分析充分表明，HSC鐵死亡過程中自噬信號可能受到m6A修飾的調(diào)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)自噬信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵靶基因 BECN1 的表達(dá)在 FTO 過表達(dá)后顯著降低。m6A RNA免疫沉淀 (MeRIP) qPCR 顯示，在HSC鐵死亡中，BECN1中m6A修飾的水平增加，但在ATG3、ATG4A、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG12和ATG16L1中沒有增加。METTL4敲低和FTO過表達(dá)顯著降低了BECN1的蛋白質(zhì)表達(dá)，而其他自噬相關(guān)基因沒有大的差異。METTL4敲低和FTO過表達(dá)介導(dǎo)的m6A降低有效抑制erastin 誘導(dǎo)的HSC中LC3-I向LC3-II 的轉(zhuǎn)化。熒光圖片顯示m6A降低抑制了erastin 誘導(dǎo)的自噬流。透射電子顯微鏡檢測進(jìn)一步證實(shí)FTO質(zhì)粒對m6A修飾的下調(diào)減少了HSC鐵死亡中的自噬囊泡。這些數(shù)據(jù)表明 m 6 A 修飾誘導(dǎo)鐵死亡與自噬激活有關(guān)。

BECN1誘導(dǎo)自噬損害m6A修飾抑制賦予的HSC鐵死亡抗性

BECN1過表達(dá)在HSC鐵死亡過程中完全削弱了m6A修飾抑制誘導(dǎo)的BECN1下調(diào)。BECN1過表達(dá)恢復(fù)了自噬體的產(chǎn)生和自噬通量。在存在 m 6 A 修飾還原的情況下。Erastin 和sorafenib誘導(dǎo)的生長抑制被 FTO過表達(dá)和 METTL4 敲低破壞，而BECN1過表達(dá)在HSC鐵死亡期間顯著促進(jìn)生長抑制。erastin和sorafenib治療在HSC中METTL4敲低或FTO過表達(dá)處理完全消除了鐵的積累、MDA、谷胱甘肽耗竭和脂質(zhì) ROS 積累。然而，BECN1過表達(dá)，抑制m6A 修飾并未顯著削弱鐵死亡事件。這些發(fā)現(xiàn)表明 BECN1過表達(dá)激活自噬削弱了抑制m6A修飾對HSC鐵死亡的抵抗力。

YTHDF1通過識別m6A結(jié)合位點(diǎn)促進(jìn)BECN1mRNA 穩(wěn)定性和激活自噬

YTHDF1蛋白和mRNA在 HSC鐵死亡期間顯著上調(diào)。放射菌素D實(shí)驗(yàn)顯示YTHDF1過表達(dá)后BECN1的mRNA半衰期較對照載體組延長。蛋白酶處理顯示YTHDF1過表達(dá)后BECN1的蛋白質(zhì)半衰期沒有顯著差異。RIP-PCR顯示YTHDF1能夠富集BECN1，RNA pulldown實(shí)驗(yàn)顯示，YTHDF1 可以很容易地與 BECN1 CDS 而不是 BECN1 的3'-UTR和5'-UTR轉(zhuǎn)錄本相互作用。MeRIP qPCR 還顯示m6A修飾在BECN1 CDS中顯著富集。轉(zhuǎn)染了BECN1 CDS的HSC-LX2 細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著增加。BECN1 mRNA 序列的CDS中的兩個(gè)m6A修飾位點(diǎn)序列。實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)BECN1-CDS-Mut2破壞了 YTHDF1 和 BECN1 mRNA 的結(jié)合，而不是 BECN1-CDS-WT和BECN1-CDS-Mut1。RNA穩(wěn)定性分析表明，YTHDF1質(zhì)粒延長了BECN1-CDS-WT mRNA和BECN1-CDS-Mut1 mRNA的半衰期，但沒有延長BECN1-CDS-Mut2 mRNA的半衰期。此外，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果還表明BECN1-CDS-Mut2 明顯破壞了erastin 誘導(dǎo)的 BECN1 蛋白上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明YTHDF1過表達(dá)通過與A1276的m6A結(jié)合位點(diǎn)CDS區(qū)域的結(jié)合來促進(jìn)BECN1 mRNA 的穩(wěn)定性。

m6A修飾的HSC特異性抑制損害erastin誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中HSC鐵死亡

肉眼觀察肝纖維化模型組與對照組相比纖維化病理改變，而erastin治療減輕了CCl 4誘導(dǎo)的肝纖維化。用VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和VA-Lip-Ythdf1-shRNA預(yù)處理完全破壞了erastin對肝纖維化的改善。蘇木精和伊紅 (H&E) 染色、馬森染色和天狼星紅染色表明，erastin 處理顯著減少了中央靜脈中的膠原沉積。VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和VA-Lip-Ythdf1-shRNA明顯逆轉(zhuǎn)了erastin對肝纖維化的影響。免疫組化染色顯示VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和VA-Lip-Ythdf1-shRNA完全消除了erastin對α-SMA表達(dá)的抑制作用。結(jié)果表明VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和VA-Lip-Ythdf1-shRNA完全消除了被erastin抑制的Acta2、Col1a1、Fn1和Des的mRNA表達(dá)。VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和 VA-Lip-Ythdf1-shRNA 顯著阻止了對 m 6 A 修飾的erastin 的上調(diào)。VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和VA-Lip-Ythdf1-shRNA通過erastin處理阻斷了自噬的激活，其特征是Becn1和Map1lc3b表達(dá)降低，Sqstm1和Fth1表達(dá)增加。VA-Lip-Mettl4-shRNA、VA-Lip-Fto-質(zhì)粒和 VA-Lip-Ythdf1-shRNA對 m 6 A 修飾的抑制完全損害了以 Ptgs2為特征的鐵死亡、氧化還原活性鐵還原和 MDA 消除。這些結(jié)果支持了以下假設(shè)：鼠肝纖維化中的 HSC 特異性 m 6 A 修飾抑制損害了erastin誘導(dǎo)的HSC鐵死亡。

索拉非尼單藥治療的人類 HSC中m6A修飾上調(diào)、促進(jìn)自噬和鐵死亡

為了在臨床上評估m6A修飾的潛在機(jī)制，分析了10名接受索拉非尼單藥治療的肝硬化并發(fā)HCC患者的部分肝切除標(biāo)本和10名未接受任何治療的肝硬化患者的肝活檢標(biāo)本。然后，根據(jù)先前的報(bào)道，使用激光捕獲顯微切割從收集的肝組織中分離出原代HSC。與之前的研究結(jié)果一致，與未經(jīng)處理的肝活檢樣本相比，索拉非尼治療的肝切除樣本中纖維化標(biāo)志物 ACTA2、COL1A1 和 FN1 的 mRNA 水平顯著降低。正如預(yù)期的那樣，PCR分析顯示METTL4和YTHDF1 的表達(dá)上調(diào)，但 FTO 的表達(dá)在索拉非尼單藥治療樣本中下調(diào)。m 6定量分析表明，與未處理的對照相比，用索拉非尼處理的原代 HSC中 m 6 A 修飾水平顯著增加。此外，索拉非尼治療可能會上調(diào)人 HSC 中鐵蛋白吞噬標(biāo)志物 BECN1 和 MAP1LC3B 的水平，并下調(diào)鐵蛋白吞噬底物 SQSTM1 和 FTH1 的水平。重要的是，索拉非尼治療增加了原代 HSC 中鐵死亡標(biāo)志物 PTGS2 的表達(dá)，以及包括氧化還原活性鐵超載、脂質(zhì)過氧化和 GSH 缺失在內(nèi)的鐵死亡事件。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明索拉非尼單一療法有助于上調(diào) m 6 A 修飾、激活自噬和誘導(dǎo)來自纖維化患者的人類 HSC 中的鐵死亡。