結(jié)腸直腸癌中m6A閱讀器IMP2穩(wěn)定ZFAS1/OLA1軸并激活Warburg效應(yīng)
越來越多的證據(jù)表明，n6 -亞甲基腺苷(m6A)調(diào)節(jié)劑參與了結(jié)直腸癌(CRC)的病因和進展。然而，m6A閱讀器參與糖酵解代謝的確切機制仍不清楚。本文旨在通過m6A與糖酵解代謝的交互作用，揭示CRC進展的新機制。
本文技術(shù)路線：
1、CRC細(xì)胞和組織中IMP1/2/3表達與異常調(diào)節(jié)的LncRNAs的相關(guān)性
IMP屬于一種m6A閱讀器，在CRC中IMP1/2/3家族如何識別lncRNAs尚未被探索。作者首先分析了IMP1，IMP2，IMP3在CRC組織中的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CRC組織中，只有IMP2過表達，且其表達量遠高于IMP1和IMP3（Fig 1B）。在7個CRC細(xì)胞系中(LOVO，CACO2、SW48、SW480、HT29、HCT116和SW620)，IMP2的表達量均高于正常人腸上皮細(xì)胞系(HIEC) (Fig. 1c)。m6A斑點雜交實驗顯示CRC細(xì)胞系，特別是HCT116，SW620，HT29細(xì)胞株的m6A水平顯著高于正常的結(jié)直腸上皮細(xì)胞HIEC中m6A水平(Fig. 1d)。這也符合IMP2的功能，即穩(wěn)定RNA表達，增加總RNA的m6A水平。然后，通過TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在CRC中，7個lncRNA候選基因中，ZFAS1、SNHG15和CRNDE均顯著表達。在CRC細(xì)胞中，ZFAS1表現(xiàn)出最顯著的過表達(Fig. 1e)。通過檢測正常對照細(xì)胞HIEC和CRC細(xì)胞系（HCT116、SW620、SW480、LOVO、HT29、CACO2、SW48）中ZFAS1、CRNDE和SNHG15的RNA表達水平，發(fā)現(xiàn)在CRC細(xì)胞中，ZFAS1表達量顯著上升(Fig. 1f)。然后，對IMP1/2/3與ZFAS1進行相關(guān)性研究，結(jié)果表明，ZFAS1與IMP2呈顯著正相關(guān)(R = 0.6476, P < 0.0001, Fig. 1g)。但ZFAS1和IMP1或IMP3之間沒有明顯的相關(guān)性。
接下來，為了研究IMP2在ZFAS1表達及其相關(guān)m6A甲基化水平中的潛在作用，作者采用組織芯片(TMA)、RNA原位雜交(ISH)和免疫組織化學(xué)(IHC)檢測了在配對的CRC組織和匹配的鄰近腫瘤對照中IMP2、m6A、和ZFAS1的表達水平(Fig. 1h)。CRC組織中IMP2, ZFAS1的表達量以及m6A表達水平明顯增高(Fig. 1i)。進一步進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IMP2和ZFAS1表達量以及m6A水平正相關(guān)(Fig. 1j)。
通過臨床分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的IMP2表達顯著縮短了總生存期和無病生存，同樣，m6A甲基化的高表達與總生存期短顯著相關(guān)，同時， ZFAS1表達較高的患者總生存期和無病生存期顯著降低(Fig. 1k)。
這些結(jié)果表明，在人類CRC細(xì)胞和組織中，IMP2過表達，并伴有相關(guān)的m6A甲基化水平和ZFAS1表達。這些指標(biāo)也顯示出未來作為CRC評估和治療生物標(biāo)志物的獨立預(yù)后預(yù)測因子的潛在功能。
Fig1 CRC細(xì)胞及患者組織中IMP1/2/3與lncRANs表達的關(guān)系
2、IMP2通過直接結(jié)合結(jié)直腸癌細(xì)胞中ZFAS1的m6A位點，促進ZFAS1的穩(wěn)定性
為了探究IMP2介導(dǎo)的m6A穩(wěn)定性及其相關(guān)ZFAS1表達在CRC腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵生物學(xué)特性，作者在HCT116和SW620 CRC細(xì)胞系中干擾IMP2表達，然后檢測IMP2和ZFAS1的表達量。結(jié)果表明，異位的IMP2表達顯著增強了ZFAS1和IMP2的表達。然而，IMP2敲低抑制了ZFAS1和IMP2的表達(Fig. 2b )。此外，在挽救實驗中，在IMP2敲低的CRC細(xì)胞中上調(diào)ZFAS1檢測到ZFAS1表達恢復(fù)(Fig. 2C )。更重要的是，RNA穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)IMP2敲低或放線菌素D在不同時間點(0,2,4,6 h) 進行處理都會縮短ZFAS1 RNA的半衰期(Fig. 2D )。這些結(jié)果初步確信，作為m6A閱讀器的IMP2對ZFAS1具有穩(wěn)定作用。為了驗證IMP2和ZFAS1之間的直接關(guān)系，通過RIP-seq發(fā)現(xiàn)，在HEK293T細(xì)胞中，異位IMP2表達顯著富集了內(nèi)源性ZFAS1(Fig. 2e)。此外，CLIP數(shù)據(jù)庫顯示IMP2蛋白具有特定的結(jié)合域識別ZFAS1序列中的m6A的RGGAC/ rach基序(Fig. 2F)。
同樣，通過Cuilab進行生信分析在ZFAS1基因中成功地發(fā)現(xiàn)了4個m6A結(jié)合基序RGGAC和1個m6A結(jié)合基序RAGAC(Fig. 2g)。catRAPID和MOE平臺也被用來確定在二級和三級結(jié)構(gòu)水平上的直接結(jié)合域(Fig. 2h, i)。ZFAS1的“RGGAC”基序(+833 ~ +869)與IMP2 蛋白序列的KH3-4結(jié)構(gòu)域(+198 ~ +249)具有顯著的交互傾向性(值= 206)和識別能力(100%)，其交互強度為98% (Fig. 2h)。
MOE軟件分析了識別 ZFAS1的RGGAC/RRACH基序與IMP2 KH3-4氨基酸結(jié)構(gòu)域交互(Fig. 2i)。采用ISH和免疫熒光(IF)進行共定位，證實ZFAS1和IMP2的表達分布一致，在HCT116和SW620細(xì)胞中都顯示主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，部分分布在細(xì)胞核中(Fig. 2j)。此外，RIP實驗發(fā)現(xiàn)，m6A抗體孵育得到了富集的ZFAS1 (Fig. 2k)。此外，作者合成了包含RGGAC/ rach識別motif (ZFAS1 m6A-WT)以及含有相應(yīng)的突變序列(ZFAS1 m6A-Mut)的具有生物素標(biāo)記的ZFAS1探針(Fig. 2m)。然后通過RNA-down實驗證實IMP2蛋白結(jié)合的是ZFAS1 m6A-WT，但不是ZFAS1m6A -Mut，而這種富集在IMP2敲低之后會消除(Fig. 2m)，表明m6A識別基序與IMP2蛋白特異性結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合相互作用。
為了確認(rèn)ZFAS1是否由IMP2 KH3-4結(jié)構(gòu)域識別m6A基序，用IMP2 KH3-4 WT或Mut載體處理HEK-293 T細(xì)胞后進行qPCR檢測，用IMP2 KH3-4 Mut載體處理后，ZFAS1表達明顯減少(Fig. 2l)。隨后，我們對ZFAS1上的m6A位點(+833 ~ +869)進行突變，檢測ZFAS1的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性也顯著降低（Fig. 2n）。到目前為止，已經(jīng)證實了IMP2通過KH3-4直接與ZFAS1的m6A位點結(jié)合，增強了ZFAS1的穩(wěn)定性(Fig. 2a)。
Fig2 IMP2通過直接與ZFAS1的m6A位點結(jié)合來提高ZFAS1的穩(wěn)定性
3、IMP2通過調(diào)節(jié)ZFAS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達進而調(diào)節(jié)生物學(xué)特性
在本研究中，為進一步闡明IMP2和ZFAS1在CRC細(xì)胞中了調(diào)控模式，通過MTT檢測在HCT116 和SW620 CRC細(xì)胞系中分析了干擾IMP2表達后細(xì)胞的增殖能力(Fig. 3b)和集落形成能力(Fig. 3C)。不出所料，異位表達的IMP2顯著促進了HCT116和SW620細(xì)胞的細(xì)胞生長和菌落形成能力，IMP2缺失抑制了這兩種類型的結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力和結(jié)腸能力（Fig. 3b, c）。此外，通過Trans-well實驗檢測其侵襲能力，結(jié)果顯示當(dāng)沉默IMP2時，遷移細(xì)胞被顯著抑制。相反，IMP2過表達顯著提高了HCT116和SW620 CRC細(xì)胞的侵襲能力(Fig. 3d)。此外，IMP2敲除增加了細(xì)胞凋亡率。然而，經(jīng)過流式細(xì)胞PE / 7 AAD雙重染色后檢測顯示，在HCT116和SW620 CRC細(xì)胞中，IMP2過表達顯著抑制了細(xì)胞凋亡率(Fig. 3e)。
為進一步確立IMP2是否影響ZFAS1在CRC細(xì)胞中的表達及其可能的生物學(xué)功能，通過在IMP2敲低的CRC細(xì)胞中增強ZFAS1的表達進行挽救實驗。結(jié)果顯示ZFAS1過表達逆轉(zhuǎn)了HCT116和SW620 的分子特征包括細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞集落形成能力、細(xì)胞遷移能力和凋亡率(Fig. 3f)。因此，這些結(jié)果表明IMP2通過促進ZFAS1的穩(wěn)定性和表達，促進CRC細(xì)胞增殖，抑制CRC細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，而IMP2可以通過調(diào)節(jié)ZFAS1的表達來恢復(fù)其對細(xì)胞表型的影響。
Fig3 IMP2通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞中ZFAS1的表達介導(dǎo)生物學(xué)特性
4、在CRC細(xì)胞中，IMP2通過OLA1作為穩(wěn)定ZFAS1的關(guān)鍵靶點
為挖掘ZFAS1下游影響CRC細(xì)胞表型和功能的靶點，對結(jié)直腸癌細(xì)胞進行相關(guān)功能研究。首先，通過熱圖聚類分析，富集了與ZFAS1過表達呈正相關(guān)的潛在下游靶點(Fig. 4b) 并且通過結(jié)合GSE128435和TCGA數(shù)據(jù)集進一步擴展CRC樣本(Fig. 4a)。發(fā)現(xiàn)線粒體能量代謝相關(guān)基因OLA1恰好出現(xiàn)在這些共表達靶點的交叉部位(Fig. 4a)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)與HIEC對照相比，OLA1在7個CRC細(xì)胞株中顯著過表達，包括SW480、HT29、LOVO、CACO2、SW48、HCT116和SW620(Fig. 4c)。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，CRC組織中OLA1水平升高(Fig. 4d)。
采用TMA和IHC檢測OLA1表達水平，如預(yù)期的那樣，標(biāo)記的OLA1水平在CRC組織與那些匹配的腫瘤鄰近對照相比，顯示了一個致癌基因的特性(Fig. 4e, f)。OLA1表達量與ZFAS1表達量呈線性正相關(guān)(Fig. 4g)。同樣，在TCGA中，OLA1和ZFAS1在CRC組織中的表達高度一致，呈線性正相關(guān)(R2 = 0.27, P < 0.0001)。臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析證實，OLA1低表達的患者在存活的患者中比例較高(Fig. 4h)。而OLA1的高表達顯著縮短了患者無病生存期以及總生存期(Fig. 4i)。為了驗證OLA1確實是被IMP2穩(wěn)定的ZFAS1的下游靶點，我們檢測了干擾IMP2后OLA1的mRNA和蛋白表達情況。有趣的是，IMP2沉默/過表達不僅降低/增加了OLA1 mRNA的表達，同時也降低或增加了OLA1的表達。然而，IMP2對OLA1的影響可以被ZFAS1完全逆轉(zhuǎn)(Fig. 4j–l)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明在人結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中，m6A修飾和m6A穩(wěn)定的ZFAS1表達正調(diào)控OLA1。進一步的預(yù)后評估表明，OLA1可以作為預(yù)測CRC臨床結(jié)局的潛在生物標(biāo)志物。
Fig4 在CRC細(xì)胞中，OLA1是經(jīng)IMP2穩(wěn)定的ZFAS1的下游關(guān)鍵靶點
5、ZFAS1通過與OLA1 OBG型功能域結(jié)合，增強OLA1活性并激活糖酵解
在之前的研究中，我們已經(jīng)確定ZFAS1與OLA1的表達呈正相關(guān)。然而，依然未明確ZFAS1與OLA1的相互作用途徑。于是作者通過ISH和IF進行檢測，細(xì)胞共定位顯示，OLA1和ZFAS1不僅在HCT116和SW620 CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分布一致，而且在細(xì)胞核中分布一致(Fig. 5b)。為了確定ZFAS1與OLA1是否有直接的結(jié)合位點，并檢測ZFAS1中關(guān)鍵m6A位點對OLA1的影響，作者將ZFAS1中的3個A堿基(+833 ~ +869)替換為U堿基，并重新預(yù)測ZFAS1的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都與OLA1 OBG型功能域結(jié)合，然而，ZFAS1-WT和OLA1的結(jié)合強度遠遠高ZFAS1-Mut和OLA1的結(jié)合。此外，ZFAS1-WT與OLA1結(jié)合充分暴露OLA1的ATP結(jié)合位點(NVGKST, 32-37) (Fig. 5c)。
此后，Pull down實驗表明，是ZFAS1-WT探針，但非ZFAS1- mut與OLA1結(jié)合，當(dāng)ZFAS1上的m6A位點(+833 ~ +869)發(fā)生突變時，ZFAS1- wt探針不能再拉下OLA1 (Fig. 5d)。當(dāng)ZFAS1的關(guān)鍵m6A位點發(fā)生突變時，ZFAS1對OLA1 atp酶活性的恢復(fù)效果消失(Fig. 5e)。這也證明了ZFAS1對OLA1 ATP酶活的促進作用取決于ZFAS1與OLA1結(jié)合暴露OLA1的ATP結(jié)合位點。
為了探討OLA1 ATP酶活性變化對CRC細(xì)胞能量代謝的影響，作者檢測了HCT116和SW620細(xì)胞中乳酸和ATP含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OLA1表達的降低不僅可以減少結(jié)直腸癌細(xì)胞中乳酸積累，還可以降低細(xì)胞中ATP含量；然而，ZFAS1 -WT能恢復(fù)OLA1不足帶來的影響 (Fig. 5f, g)。這一結(jié)果與OLA1的ATP水解功能相矛盾，于是推測ATP產(chǎn)生的主要途徑是否被阻斷了。為了驗證這一推測，作者進行了細(xì)胞外酸化率實驗，以檢測OLA1的變化對CRC細(xì)胞糖酵解能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低OLA1的表達可顯著降低CRC細(xì)胞的糖酵解能力，而ZFAS1-WT而可以恢復(fù)OLA1表達減少對CRC細(xì)胞糖酵解能力降低的影響(Fig. 5h)。
綜上所述，ZFAS1可以直接與OLA1的OBGtype功能域結(jié)合，暴露OLA1上的ATPbinding位點，從而增強OLA1的ATP水解能力。OLA1增強ATP水解能力，促進乳酸的積累和ATP合成原料的釋放，從而激活CRC細(xì)胞的糖酵解途徑，最終促進CRC中能量的釋放。
Fig 5 ZFAS1通過與OLA1 OBG型結(jié)構(gòu)域結(jié)合增強OLA1活性并激活糖酵解
6、線粒體能量代謝受IMP2-ZFAS1-OLA1信號轉(zhuǎn)軸的影響
為了進一步闡明在CRC進展過程中參與線粒體能量代謝的IMP2穩(wěn)定信號軸的關(guān)鍵功能，首先在電子顯微鏡下觀察了IMP2沉默后線粒體的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，在CRC細(xì)胞中，IMP2沉默后，線粒體明顯腫脹和受損，線粒體形態(tài)恢復(fù)正常(Fig. 6b)。也就是說，在CRC中，大多數(shù)細(xì)胞只能依賴糖酵解提供能量，而IMP2沉默后，CRC細(xì)胞的糖酵解能量比例會顯著降低。為了驗證我們的猜想，我們首先用IMP2進行干預(yù)，檢測HK2（糖酵解的關(guān)鍵蛋白質(zhì)）和PDHA1（氧化磷酸化的關(guān)鍵蛋白）的表達。結(jié)果顯示，IMP2過表達促進HK2表達，抑制PDHA1表達(Fig. 6c)。IMP2沉默可顯著降低HCT116和SW620 CRC中HK2的表達，增加PDHA1的表達(Fig. 6c)。此外，在CRC細(xì)胞中，ZFAS1沉默/過表達及IMP2過表達/沉默后，HK2和PDHA1的表達水平恢復(fù)(Fig. 7d)。IMP2過表達顯著促進乳酸釋放，提高ATP含量，然而，敲低IMP2導(dǎo)致乳酸和ATP含量的釋放顯著減少，而ZFAS1可以完全逆轉(zhuǎn)IMP2的作用(Fig. 6e, f)。細(xì)胞能量代謝檢測進一步表明，IMP2沉默降低了細(xì)胞的糖酵解能力，而ZFAS1可以逆轉(zhuǎn)IMP2沉默對這兩種類型的CRC細(xì)胞糖酵解水平降低的影響。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)揭示了在CRC發(fā)生和發(fā)展的過程中，IMP2通過ola1調(diào)節(jié)ATP水解和糖酵解介導(dǎo)線粒體能量代謝促進m6A表達。
Fig6 線粒體能量代謝受IMP2-ZFAS1-OLA1信號轉(zhuǎn)軸的影響
7、IMP2在體內(nèi)通過穩(wěn)定ZFAS1促進細(xì)胞增殖
為確認(rèn)IMP2-ZFAS1-OLS1軸在體內(nèi)的生物學(xué)功能，將4周齡BALB/c裸鼠腋窩皮下接種4種穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞(5 × 106細(xì)胞) 建立異種移植模型，分別為shNC組、shIMP2組、shIMP2 + pcDH組、shIMP2 + ZFAS1組(Fig. 7a)。在這項研究中，移植后10天出現(xiàn)了一個明顯的異種移植瘤，在第40天切除異種移植瘤或隨訪至死亡(Fig. 7a)。預(yù)后評估顯示，在shIMP2和ZFAS1載體共轉(zhuǎn)染后，異種移植小鼠的生存時間顯著縮短(Fig. 7b)，提示IMP2與ZFAS1在CRC預(yù)后評估中具有協(xié)同作用。此外，轉(zhuǎn)染了shIMP2載體的異種移植小鼠的腫瘤體積、大小和重量均顯著降低，然而，與shIMP2和ZFAS1共轉(zhuǎn)染后，觀察到顯著增加(Fig. 7c–e)。結(jié)果表明，在異種移植小鼠模型中，ZFAS1過表達顯著逆轉(zhuǎn)了IMP2沉默對腫瘤生長的抑制作用。同樣，在第0、10和40天采集的具有代表性的異種移植物進行研究也得到了相同的結(jié)論(Fig. 7f)。
ISH和IHC檢測證實，在異種移植瘤中，shIMP2組和shIMP2 + pcDH組的ZFAS1和OLA1表達較NC組明顯降低；而shIMP2 + ZFAS1組與NC組無顯著差異(Fig. 7g)。同樣，qPCR和WB檢測也得到相同的結(jié)論，包括在異種移植瘤中與shIMP2和ZFAS1載體共轉(zhuǎn)染后的ZFAS1和OLA1(圖7 h-j)?？傊w內(nèi)實驗表明敲低IMP2通過誘導(dǎo)m6A穩(wěn)定性，能促進 IMP2與ZFAS1/OLA1軸的相互作用，抑制異種移植物的腫瘤生長。
Fig7 IMP2在體內(nèi)通過穩(wěn)定ZFAS1促進細(xì)胞增殖
本文發(fā)現(xiàn)在CRC增殖和進展過程中，m6A 閱讀器IMP2與長鏈非編碼RNA (lncRNA) ZFAS1以m6A調(diào)節(jié)依賴的方式進行調(diào)控，隨后增加了Obg-like ATPase 1 (OLA1)的募集以及三磷酸腺苷(ATP)水解和糖酵解。
參考文獻：
Lu, S., et al., N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol, 2021. 14(1): p. 188.