多發(fā)性骨髓瘤PRMT5通過(guò)沉默CASP1調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種惡性腫瘤，起源于骨髓中產(chǎn)生病理性抗體的漿細(xì)胞的廣泛增殖，約占血液腫瘤的10%。目前，許多研究已經(jīng)證明，MM患者具有相同的遺傳特征；因此，MM被認(rèn)為是遺傳變異累積的結(jié)果。然而，MM的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，需要進(jìn)一步研究。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）是一種參與多種血液惡性腫瘤腫瘤細(xì)胞進(jìn)展的酶。有研究發(fā)現(xiàn)抑制PRMT5的活性增加了CASP1的表達(dá)，促進(jìn)了MM細(xì)胞焦亡。PRMT5的高表達(dá)或CASP1的低表達(dá)與MM的總體生存率低相關(guān)。該研究2021年9月發(fā)表在《Cell Death and Disease》，IF: 8.469。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1.   PRMT5在MM中過(guò)表達(dá)

作者對(duì)來(lái)自Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的7個(gè)MM數(shù)據(jù)集進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。與非癌組織相比，發(fā)現(xiàn)MM組織中PRMT5顯著上調(diào)（P=0.020，圖1A）。此外，結(jié)合MMRF CoMMpass（n=859）和基因型組織表達(dá)（GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)（n=62）進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，表明PRMT5在MM組織中的表達(dá)高于非癌組織（P=0.00034，圖1B）。通過(guò)分析MMRF CoMMpass數(shù)據(jù)庫(kù)中787例MM患者的臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)高PRMT5表達(dá)與較差的無(wú)進(jìn)展生存率相關(guān)（P=0.015，HR=1.472，圖1C）。PCR結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)MM樣品中的PRMT5水平顯著高于對(duì)照樣品，而MGU樣品中未觀察到顯著變化（圖1D）。包括MGUS樣本（GSE6477和GSE5900）在內(nèi)的數(shù)據(jù)集顯示，健康和MGUS患者之間PRMT5的表達(dá)沒(méi)有差異。此外，通過(guò)使用蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)PRMT5蛋白在MM樣本和MM細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)（圖1E，F）。

圖1 PRMT5在MM中過(guò)表達(dá)

2.  PRMT5基因敲除觸發(fā)MM細(xì)胞膜破裂和PI+/Annexin V+增加

設(shè)計(jì)干擾PRMT5表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)western blotting和qRT-PCR驗(yàn)證（圖2A，B），并且這些結(jié)果在兩種細(xì)胞系中靶向PRMT5的免疫熒光也進(jìn)一步證實(shí)（圖2C）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，敲除PRMT5可增加NCI-H929和U266細(xì)胞的PI+數(shù)量，尤其是在PI+/Annexin V+結(jié)構(gòu)域（圖2D）。這種表型可能是指晚期凋亡或焦亡，兩者都表現(xiàn)為細(xì)胞膜兩極引起的PI染色。由于CASP3的激活是細(xì)胞凋亡執(zhí)行途徑的觸發(fā)因素，作者分析了sh-PRMT5細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞中裂解的CASP3的表達(dá)，但結(jié)果無(wú)顯著性（圖2E）。此外，TEM圖像顯示sh-PRMT5細(xì)胞具有細(xì)胞質(zhì)腫脹和質(zhì)膜破裂，這支持了細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)（圖2F）。這些結(jié)果表明，PRMT5的敲除激活MM細(xì)胞系的焦亡。

圖2 PRMT5激活MM細(xì)胞系焦亡

3.   PRMT5上調(diào)與CASP1呈負(fù)相關(guān)

使用Affymetrix Clariom S陣列芯片對(duì)三個(gè)NCI-H929細(xì)胞樣本和三個(gè)PRMT5敲除（PRMT5 kd）NCI-H929細(xì)胞樣本進(jìn)行基因組陣列，以確定PRMT5在MM發(fā)病機(jī)制中的功能（圖3A）。結(jié)果顯示，NCI-H929和U266細(xì)胞中的CASP1均顯著增加（圖3B）。為了證實(shí)CASP1作為PRMT5的下游靶點(diǎn)，與陰性對(duì)照組相比，作者評(píng)估了轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA-2后MM細(xì)胞系中CASP1和裂解的CASP1的蛋白表達(dá)水平。值得注意的是，PRMT5的敲除導(dǎo)致CASP1和裂解的CASP1顯著升高，表明在MM細(xì)胞中，PRMT5使CASP1沉默（圖3C）。此外，MM患者骨髓源漿細(xì)胞CASP1 mRNA表達(dá)顯著降低，與PRMT5呈負(fù)相關(guān)（圖3D, E）。

圖3 PRMT5上調(diào)與CASP1呈負(fù)相關(guān)

4.   在MM細(xì)胞系中敲除CASP1可以挽救PRMT5缺失引起的焦亡現(xiàn)象

為了研究PRMT5是否通過(guò)抑制CASP1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞熱下垂，在NCI-H929和U266細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)CASP1（圖4A）。結(jié)果顯示，CASP1過(guò)表達(dá)顯著抑制了NCI-H929和U266細(xì)胞的細(xì)胞活力（補(bǔ)充圖1B），并增加了PI+/Annexin V+細(xì)胞的數(shù)量（圖4B）。結(jié)果表明，CASP1的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了GSDMD的激活和白細(xì)胞介素-1β（IL-1b）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）的分泌（圖4C）。同樣，在PRMT5缺失的細(xì)胞中，CASP1表達(dá)升高，激活了焦亡途徑。然而，當(dāng)PRMT5缺失細(xì)胞中的siRNA敲除CASP1時(shí)（圖4D），焦亡途徑的標(biāo)記物顯著下調(diào)，焦亡細(xì)胞的百分比顯著降低（圖4E，F）使用小鼠異種移植模型進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CASP1的敲除部分逆轉(zhuǎn)了體內(nèi)PRMT5缺失的NCI-H929細(xì)胞的增殖缺陷（圖4G，H）。上述結(jié)果表明，PRMT5缺失引起的細(xì)胞焦亡通過(guò)敲除CASP1得以挽救。

圖4通過(guò)敲除CASP1挽救了PRMT5缺失引起的細(xì)胞焦亡

5.  使用PRMT5抑制劑GSK591處理可降低CASP1啟動(dòng)子H4R3me2s水平

檢測(cè)PRMT5是否直接調(diào)控CASP1的表達(dá)，并通過(guò)ChIP檢測(cè)和qRT-PCR分析了PRMT5介導(dǎo)的H4R3me2s在CASP1基因啟動(dòng)子周?chē)母患闆r。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在PRMT5缺失的NCI-H929和U266細(xì)胞中，CASP1啟動(dòng)子區(qū)域的H4R3me2s水平顯著降低（圖5A）。為了抑制CASP1基因啟動(dòng)子上的H4R3me2s，用PRMT5的特異性抑制劑-GSK591處理NCI-H929和U266細(xì)胞。用0、1、5和10μM GSK591（B6182，Apexbio）處理NCI-H929和U266細(xì)胞，以研究其生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5μM GSK591處理顯著觸發(fā)NCIH929和U266細(xì)胞中PI+細(xì)胞比例的增加，表明膜破裂和繼發(fā)性細(xì)胞死亡由熱下垂引起（圖5B）。接下來(lái)，作者檢測(cè)了不同濃度GSK591處理的NCI-H929和U266細(xì)胞中CASP1的表達(dá)，以探討抑制PRMT5的酶活性是否可以重新激活CASP1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)5μM GSK591增加了CASP1的表達(dá)（圖5C）。這些結(jié)果表明，GSK591通過(guò)抑制PRMT5降低H4R3me2s水平，從而激活CASP1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

圖5 PRMT5抑制劑GSK591處理后CASP1啟動(dòng)子H4R3me2s水平降低

6.  PRMT5的高表達(dá)和CASP1的低表達(dá)與MM患者較差的臨床預(yù)后相關(guān)

作者收集了108例新診斷的MM患者的臨床資料，并通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定了PRMT5和CASP1的表達(dá)水平。MM患者的骨髓組織分為PRMT5高組和PRMT5低組（圖6A），以及CASP1高組和CASP1低組（圖6B）。在MM患者中觀察到PRMT5表達(dá)與ISS分期之間存在顯著相關(guān)性（表1）。此外，Kaplan-Meier曲線(xiàn)（圖6C，D）表明，高PRMT5表達(dá)（P=0.022）和低CASP1表達(dá)（P=0.00063）與MM總體存活率低相關(guān)。合并這兩種變體，發(fā)現(xiàn)與PRMT5高表達(dá)和CASP1低表達(dá)的患者相比，PRMT5低表達(dá)和CASP1高表達(dá)的患者的生存率顯著降低（圖6E，P=0.0037）。此外，單變量（P<0.001）和多變量（P=0.007）Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析均表明PRMT5上調(diào)是MM患者生存率低的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素（表2）。

圖6 在MM患者中，PRMT5的高表達(dá)和CASP1的低表達(dá)與較差的臨床預(yù)后相關(guān)

表1 PRMT5表達(dá)與MM臨床病理特征的關(guān)系

表2 MM患者生存的單因素和多因素臨床病理特征分析

主要結(jié)論：

該研究結(jié)果表明，PRMT5通過(guò)沉默CASP1在MM中調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡，PRMT5抑制劑GSK591可能作為MM的潛在治療藥物。

參考文獻(xiàn)：

Xia T, Liu M, Zhao Q, Ouyang J, Xu P, Chen B. PRMT5 regulates cell pyroptosis by silencing CASP1 in multiple myeloma. Cell Death Dis. 2021; 12(10):851.