順式作用lnc-Cxcl2抑制中性粒細胞介導的病毒感染性肺炎

病毒感染過程中上皮細胞產(chǎn)生的趨化因子對于中性粒細胞的招募非常重要，適當?shù)恼{(diào)節(jié)趨化因子產(chǎn)生對于限制炎癥和減緩隨后的組織損傷非常重要。在病毒感染和炎癥過程中，上皮細胞lncRNA、RNA結(jié)合蛋白的表達及其功能相互作用尚不清楚。本文發(fā)現(xiàn)lnc-Cxcl2順式作用通過抑制病毒感染中上皮細胞CXCL2的表達來抑制中性粒細胞介導的肺炎。該于2021年10月發(fā)表在《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States》IF：9.58期刊上。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、lnc-Cxcl2的表達在小鼠肺上皮細胞核中上調(diào)表達以響應(yīng)病毒感染

首先，作者通過文獻確定了趨化因子CXCL2為研究目前，然后通過RNA測序篩選到順式調(diào)節(jié)CXCL2的lncRNA，將其命名為lnc-Cxcl2。首先檢測了lnc-Cxcl2的表達，如圖1A-D所示，和測序結(jié)果一致，lnc-Cxcl2在肺上皮細胞系中的表達響應(yīng)病毒感染，并和CXCL2的mRNA表達趨勢一致。并且用WB檢測到了其轉(zhuǎn)錄本的表達（圖1E）。原位雜交顯示隨著病毒感染延長，lnc-Cxcl2在核中的組分逐漸增加（圖1F）。NF-κB inhibitor處理后，CXCL2的mRNA表達和lnc-Cxcl2的表達都顯著下降了（圖1H-G）。表明lnc-Cxcl2是一個核lncRNA，通過NF-κB信號通路響應(yīng)病毒感染。

圖1 lnc-Cxcl2在小鼠肺上皮細胞核中表達增加，以應(yīng)對病毒感染

2、lnc-Cxcl2選擇性抑制病毒感染期肺上皮細胞CXCL12的表達

對lnc-Cxcl2敲除和對照的細胞進行病毒感染，然后轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)21個基因在敲除組異常表達（圖2A），其中CXCL2上調(diào)表達（圖2B）。和轉(zhuǎn)錄組測序一致，我們發(fā)現(xiàn)Cxcl2的表達和分泌型CXCL2的表達在lnc-Cxcl2敲除組顯著升高（圖2C-D）。并且lnc-Cxcl2缺陷增加了IAV和VSV感染的AECs和TECs細胞中的Cxcl2表達，但在AMs中沒有（圖2E）。因此， lnc-Cxcl2在病毒感染時選擇性地抑制小鼠肺上皮細胞中Cxcl2的表達。

圖2 lnc-Cxcl2選擇性抑制病毒感染時肺上皮細胞中Cxcl2的表達

3、lnc-Cxcl2抑制流感病毒誘導的體內(nèi)肺炎癥

lnc-Cxcl2?/?小鼠在外觀、體重和行為上與lnc-Cxcl2+/+同窩小鼠幾乎沒有區(qū)別。并且lnc-Cxcl2+/+和lnc-Cxcl2?/?小鼠脾臟免疫細胞包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的比例也相似，提示lnc-Cxcl2缺乏并不影響小鼠免疫細胞的發(fā)育。所以，用IAV鼻腔感染這些小鼠，以肺上皮細胞為靶點感染并誘導肺炎癥和組織損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與lnc-Cxcl2+/+小鼠相比，lnc-Cxcl2?/?小鼠在IAV感染后，體重下降更多，肺中Cxcl2的表達增加，但不包括其他促炎細胞因子，如Ccl2、Ifnb1或Tnf (圖3A-B)。此外，lnc-Cxcl2?/?小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中CXCL2水平和中性粒細胞數(shù)均高于lnc-Cxcl2+/+小鼠（圖3C-D）。與此一致的是，IAV感染后lnc-Cxcl2?/?小鼠與lnc-Cxcl2+/+小鼠相比，肺中性粒細胞浸潤更嚴重，炎癥更嚴重，組織損傷更嚴重（圖3E-F）。表明lnc-Cxcl2?/?小鼠中由于CXCL2的表達增高所以更多的中性粒細胞被募集至肺部，加重病情。表明lnc-Cxcl2通過抑制CXCL2表達和中性粒細胞募集抑制流感病毒誘導的體內(nèi)肺炎癥。

圖3 lnc-Cxcl2在體內(nèi)抑制流感病毒誘導的肺炎癥

4、lnc-Cxcl2以順式作用結(jié)合并維持Cxcl2啟動子的染色質(zhì)抑制狀態(tài)

為了探究lnc-Cxcl2如何抑制Cxcl2的，首先作者檢測了lnc-Cxcl2對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)核定位轉(zhuǎn)錄因子P65, P50, STAT1, STAT3或c-JUN的表達都不受lnc-Cxcl2的調(diào)控，所以猜測lnc-Cxcl2是以順式作用的方式調(diào)控Cxcl2。作者發(fā)現(xiàn)lnc-Cxcl2缺陷增加了Cxcl2 pre-mRNA水平以應(yīng)對病毒感染(圖4A)，Cxcl2啟動子的染色質(zhì)可訪問性（以DNase敏感性表示）也增加了，以響應(yīng)病毒感染(圖4 B)。一致地，Cxcl2啟動子中H3K4me3和CREB結(jié)合蛋白(CBP)的水平，是兩種活性轉(zhuǎn)錄標記，在lnc-Cxcl2敲除細胞中增加（圖4C-D）。Cxcl2啟動子的總RNA聚合酶和磷酸化RNA聚合酶II水平也在lnc-Cxcl2敲除細胞中增加（圖4E-F），提示lnc-Cxcl2抑制Cxcl2啟動子的染色質(zhì)可及性和Cxcl2的轉(zhuǎn)錄。

為了探究lnc-Cxcl2如何調(diào)控Cxcl2啟動子染色質(zhì)可及性，使用antisense和lnc-Cxcl2探針分離lnc-Cxcl2結(jié)合的染色質(zhì)，發(fā)現(xiàn)探針可以成功捕獲lnc-Cxcl2，特別是在VSV干擾后，并且Cxcl2的啟動子兩個κB區(qū)域顯著富集lnc-Cxcl2探針。表明在病毒感染期間，lnc-Cxcl2順式結(jié)合Cxcl2啟動子并維持Cxcl2啟動子染色質(zhì)的抑制狀態(tài)。

圖4 lnc-Cxcl2以順式結(jié)合并維持Cxcl2啟動子受抑制的染色質(zhì)狀態(tài)

5、lnc-Cxcl2通過核糖核蛋白La抑制Cxcl2表達

接下來探究lnc-Cxcl2是否通過其相互作用的蛋白抑制染色質(zhì)的可及性。使用RNA pull-down和MS鑒定與lnc-Cxcl2相互作用的核蛋白，得到核糖核蛋白La。為了驗證lnc-Cxcl2通過與La相互作用抑制Cxcl2轉(zhuǎn)錄的假設(shè)，首先證實lnc-Cxcl2與La之間的相互作用（圖5A-B）。構(gòu)建La的截短突變體，發(fā)現(xiàn)只有包含第二個RRM的La片段與lnc-Cxcl2結(jié)合，表明La通過RRM2與lnc-Cxcl2相互作用（圖5C）。為了研究La在調(diào)節(jié)Cxcl2表達中的作用，構(gòu)建了La缺陷(Ssb?/?)的MLE-12細胞。發(fā)現(xiàn)La缺失不僅增加了Cxcl2的表達，而且還增加了其他趨化因子和促炎細胞因子的表達，如Ccl2、Ifnb1和Tnf，以應(yīng)對病毒感染（圖5D）。然后，研究了La如何抑制這些細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)La缺失增加了Cxcl2和Ccl2啟動子的染色質(zhì)可及性（圖5E）?？傊?，雖然La抑制許多細胞因子的表達，但lnc-Cxcl2可以結(jié)合Cxcl2啟動子，在病毒感染過程中通過核糖核蛋白La抑制Cxcl2順式表達。

圖5 lnc-Cxcl2通過核糖核蛋白La抑制Cxcl2表達

6、lnc-CXCL2-4-1抑制人肺上皮細胞免疫細胞因子表達

雖然lncRNA在不同物種之間被認為是低保守的，但在人類細胞中是否也存在類似的機制。通過搜索lncRNA數(shù)據(jù)庫，在人類CXCL2的下游發(fā)現(xiàn)了4個與CXCL2相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，分別為lnc-CXCL2-1-1、lnc-CXCL2-2-1、lnc-CXCL2-3-1、lnc-CXCL2-4-1。其中，lnc-CXCL2-3-1預測有編碼框，因此只有其他3個轉(zhuǎn)錄本被認為是ncRNA，然而，這三種lncRNA的具體功能尚未被闡明。因此，首先檢測了這些lncRNA在A549人肺上皮細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)IAV感染后lnc-CXCL2-1-1的表達顯著增加，而lnc-CXCL2-1-1和lnc-CXCL2-2-1的表達僅輕微增加（圖6A）。然后檢測lnc-CXCL2- 4-1是否參與了趨化因子表達的調(diào)控。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，IAV感染后lnc-CXCL2-4-1沉默的A549細胞中有364個基因表達上調(diào)，32個基因表達下調(diào)（圖6B）。對這些差異表達基因的GO分析表明，它們的分子功能豐富于細胞因子活性，包括趨化因子、干擾素和其他促炎細胞因子（圖6C-D）。進一步證實沉默lnc-CXCL2-4-1確實增加了IAV感染后A549細胞中CXCL2和CXCL8的表達。此外，lnc-CXCL2-4-1與La相互作用，沉默La的表達增加了IAV感染后A549細胞中CXCL2和CXCL8的表達(圖6 F和G)，表明lnc-CXCL2-4-1抑制細胞因子的表達。綜上所述，這些結(jié)果表明，不同物種的宿主通過增加一種lncRNA的表達來抑制病毒誘導的肺炎癥，該lncRNA可以反饋抑制肺上皮細胞中趨化因子的產(chǎn)生。

圖6 lnc-CXCL2-4-1抑制人肺上皮細胞中細胞因子的表達

參考文獻：

Liu Shuo., Liu Jiaqi., Yang Xue., Jiang Minghong., Wang Qingqing., Zhang Lianfeng., Ma Yuanwu., Shen Zhongyang., Tian Zhigang., Cao Xuetao.(2021). Cis-acting lnc-Cxcl2 restrains neutrophil-mediated lung inflammation by inhibiting epithelial cell CXCL2 expression in virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 118(41), undefined. doi:10.1073/pnas.2108276118