糖尿病皮膚中m6A reader YTHDC1靶向SQSTM1調(diào)節(jié)自噬
在糖尿病皮膚中，巨噬細(xì)胞/自噬的失調(diào)有助于傷口愈合的延遲。N6-甲基腺苷(m6A) RNA修飾在調(diào)節(jié)自噬中發(fā)揮重要作用。本研究揭示了YTHDC1通過(guò)調(diào)節(jié)糖尿病角質(zhì)細(xì)胞中SQSTM1核mRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)自噬的功能最終作用于皮膚傷口愈合。本文于2021年10月發(fā)表在《Autophagy》IF:16.016期刊上。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、SQSTM1是高糖處理的HaCaT細(xì)胞的關(guān)鍵基因
近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的皮膚表皮組織明顯薄于對(duì)照組（Figure 1A,B）。為了尋找糖尿病皮膚表皮變薄的機(jī)制，用高糖處理角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞。考慮到高糖會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生額外的滲透壓力，甘露醇用于高糖的滲透控制對(duì)照。對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得差異表達(dá)基因，其中與正常糖+甘露醇組比較，高糖組SQSTM1顯著下調(diào) (Figure 1C, D)。為了挖掘關(guān)鍵基因，通過(guò)Cytoscape軟件的cyto-Hubba插件分析，發(fā)現(xiàn)SQSTM1是高糖處理HaCaT細(xì)胞中調(diào)控其他重要基因的潛在關(guān)鍵靶基因，具有較高的相關(guān)性(Figure 1E)。通過(guò)PPI獲得了包括SQSTM1在內(nèi)的得分最高的基因模塊(Figure 1F)。此外，一部分可見(jiàn)通路與表皮、細(xì)胞因子和凋亡緊密連接的通路在KEGG網(wǎng)絡(luò)圖中展示了(Figure 1G)。以上表明SQSTM1是高糖處理的HaCaT細(xì)胞的關(guān)鍵基因。
圖1 SQSTM1是高糖處理的角質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵基因
2、高糖誘導(dǎo)SQSTM1下調(diào)并抑制角質(zhì)細(xì)胞自噬
如Figure 2A所示，SQSTM1的mRNA表達(dá)以時(shí)間依賴的方式逐漸降低。由于SQSTM1是自噬關(guān)鍵基因，所以檢測(cè)了高糖對(duì)自噬的影響。結(jié)果表明，高滲應(yīng)激對(duì)SQSTM1表達(dá)水平、MAP1LC3B/LC3B-II:-I比值、MAP1LC3B/LC3B-II:TUBB(微管蛋白β I類)的比值均無(wú)明顯影響。相比之下，短期高糖處理導(dǎo)致SQSTM1表達(dá)水平、MAP1LC3B/LC3B-II:-I比值和MAP1LC3B/LC3B-II: TUBB比值顯著降低（Figure 2B, C）。然后，通過(guò)串聯(lián)轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-MAP1LC3B /LC3B檢測(cè)自噬通量。結(jié)果顯示高糖處理后自噬小體和自噬溶酶體的形成都顯著減少，表明自噬通路受損（Figure 2D-F）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，在其余角質(zhì)細(xì)胞系NHEK中重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如Figure 2G-2K，結(jié)果得出一致的結(jié)論。隨后用投射電子顯微鏡觀察自噬水平，發(fā)現(xiàn)HaCaT細(xì)胞自噬活性在高血糖的短期慢性作用下受到明顯抑制（Figure 2L）。糖尿病病人和非糖尿病人皮膚樣本的免疫組化顯示，在長(zhǎng)期糖尿病皮膚表皮中發(fā)現(xiàn)SQSTM1和MAP1LC3B/ LC3B的表達(dá)均減少(Figure 2M,N)。綜上，短期和長(zhǎng)期高血糖均可誘導(dǎo)角化細(xì)胞中SQSTM1表達(dá)水平降低和自噬抑制。
圖2高糖誘導(dǎo)角化細(xì)胞SQSTM1下調(diào)和自噬通量受損
用siRNA構(gòu)建SQSTM1敲除HaCaT細(xì)胞系(Figure 3A,B)。根據(jù)文獻(xiàn)，作者決定研究SQSTM1對(duì)HaCaT細(xì)胞KEAP1-NFE2L2通路的影響。結(jié)果顯示，敲除SQSTM1后HaCaT細(xì)胞中KEAP1表達(dá)上調(diào)，NFE2L2表達(dá)下調(diào)(Figure 3B,C)，高糖處理后期表達(dá)趨勢(shì)也如此(Figure 3D,E)。此外，敲除SQSTM1也導(dǎo)致自噬體形成抑制和自噬通量受損(Figure 3F-H)。這些結(jié)果表明SQSTM1在角質(zhì)細(xì)胞自噬中的關(guān)鍵基因。
圖3減少SQSTM1阻斷角質(zhì)細(xì)胞自噬通量
4、m6A reader蛋白YTHDC1與SQSTM1 mRNA的相互作用在高糖誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞中下降
隨后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖處理后SQSTM1 mRNA水平在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都顯著下降（Figure 4A）。前期研究表明，m6A參與了細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控，因此，采用RNA點(diǎn)雜交方法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中m6A水平。觀察發(fā)現(xiàn)，短期高糖處理后，HaCaT細(xì)胞中m6A水平顯著降低(Figure 4B)。然后，細(xì)胞總RNA用于免疫沉淀m6A抗體，發(fā)現(xiàn)SQSTM1 mRNA被m6A抗體顯著下拉（Figure 4C）。
在各種m6A閱讀器中，核閱讀器YTHDC1被認(rèn)為具有多種作用，包括調(diào)節(jié)mRNA剪接、加速mRNA輸出和加速轉(zhuǎn)錄本的衰退。因此，本研究假設(shè)YTHDC1參與了HaCaT細(xì)胞中SQSTM1表達(dá)的調(diào)控。首先，檢測(cè)YTHDC1蛋白是否與SQSTM1 mRNA相互作用。RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明，YTHDC1蛋白可與SQSTM1 mRNA相互作用(Figure 4D)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果，進(jìn)行RNA親和分離，驗(yàn)證了SQSTM1 mRNA與YTHDC1蛋白相互作用(Figure 4E)。然后，考慮YTHDC1的異常調(diào)節(jié)是否有助于HaCaT細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的SQSTM1的減少。為了研究這一假設(shè)，在HaCaT細(xì)胞中評(píng)估不同濃度的葡萄糖和甘露醇(滲透控制)處理48和72 h后YTHDC1的表達(dá)。與正常葡萄糖組和滲透對(duì)照組相比，短期中高糖和高糖處理組YTHDC1表達(dá)水平明顯下調(diào)(Figure 4F,G)。同樣，短期高糖處理導(dǎo)致NHEK細(xì)胞中YTHDC1下調(diào)(Figure 4H,I)。免疫組化染色結(jié)果顯示，慢性高血糖作用下，糖尿病皮膚表皮中YTHDC1水平降低(Figure 4J,K)。這些結(jié)果表明，在短期和長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，角化細(xì)胞中與SQSTM1 mRNA相互作用的m6A reader YTHDC1均降低。
圖4 m6A reader蛋白YTHDC1與角化細(xì)胞中的SQSTM1 mRNA相互作用
5、YTHDC1調(diào)節(jié)高糖處理的角質(zhì)細(xì)胞中SQSTM1的表達(dá)和自噬通量
為了檢測(cè)YTHDC1對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響，用siRNA敲除HaCaT中其表達(dá)（Figure 5A,B）。敲除YTHDC1表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡比例增加，傷口愈合能力下降（Figure 5C-F）。表明YTHDC1影響角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)功能。
圖5YTHDC1影響角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)功能
推測(cè)YTHDC1可能在調(diào)控SQSTM1表達(dá)中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步闡明二者的關(guān)系，研究YTHDC1對(duì)SQSTM1的影響。發(fā)現(xiàn)YTHDC1基因敲低導(dǎo)致SQSTM1 mRNA和蛋白表達(dá)水平和MAP1LC3B/LC3B-II:-I比率顯著降低，自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量顯著減少（Figure 6A-C），表明敲除YTHDC1損害了自噬通量。隨后探究YTHDC1在高糖處理的角質(zhì)細(xì)胞中對(duì)SQSTM1表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示高糖處理導(dǎo)致的角質(zhì)細(xì)胞中YTHDC1和SQSTM1表達(dá)以及MAP1LC3B/LC3B-II:-I比率下降可以被YTHDC1過(guò)表達(dá)挽救（Figure 6G,H）。此外，高糖誘導(dǎo)導(dǎo)致的自噬通量減少也可以被YTHDC1過(guò)表達(dá)挽救（Figure 6I-K）。以上表明YTHDC1調(diào)節(jié)高糖處理的角質(zhì)細(xì)胞中SQSTM1的表達(dá)和自噬通量。
圖6 YTHDC1的敲除降低了SQSTM1的表達(dá)和自噬通量
6、敲除YTHDC1可加速SQSTM1 mRNA的降解并抑制自噬通量
據(jù)報(bào)道，YTHDC1介導(dǎo)m6A修飾的mRNA的核輸出。因此，評(píng)價(jià)了SQSTM1 mRNA的表達(dá)水平。令人驚訝的是，結(jié)果顯示，敲除YTHDC1后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中SQSTM1 mRNA均減少，但不影響ACTB和RNU6 1 mRNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)水平（Figure 7A-C）。所以進(jìn)一步檢測(cè)敲除YTHDC1是否影響細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中SQSTM1 mRNA的穩(wěn)定性。用放線菌素D抑制HaCaT細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。敲除YTHDC1可促進(jìn)細(xì)胞核中SQSTM1 mRNA的降解，但不影響細(xì)胞質(zhì)中SQSTM1 mRNA的穩(wěn)定性（Figure 7D, E）。這些數(shù)據(jù)揭示了YTHDC1在維持細(xì)胞核中m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性方面的新作用。
已知ELAVL1是一種RNA穩(wěn)定蛋白，可與含有m6A修飾的mRNA相互作用。因此，本研究探究YTHDC1是否與ELAVL1協(xié)同調(diào)控SQSTM1的表達(dá)。免疫共沉淀結(jié)果顯示ELAVL1可與YTHDC1親和分離，反之亦然（Figure 7F,G），提示YTHDC1可與ELAVL1相互作用。此外，RNA親和分離和RIP-qPCR結(jié)果表明，ELAVL1與SQSTM1 mRNA相互作用(Figure 7H,I)。敲除ELAVL1基因?qū)е耂QSTM1 mRNA表達(dá)水平降低（Figure 7L）。這些數(shù)據(jù)表明，YTHDC1與ELAVL1相互作用并協(xié)同調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞中SQSTM1的表達(dá)。
圖7 YTHDC1協(xié)同ELAVL1調(diào)控SQSTM1的表達(dá)
7、下調(diào)YTHDC1可減少小鼠角質(zhì)細(xì)胞的自噬并延遲傷口愈合
為了給YTHDC1和SQSTM1在高血糖慢性作用下糖尿病傷口愈合中的作用提供體內(nèi)證據(jù)，對(duì)BKD-Leprem2Cd479/Nju (db/db)小鼠、糖尿病小鼠模型和年齡匹配的野生型(WT)小鼠進(jìn)行研究。如免疫組化染色所示，與年齡匹配的WT小鼠相比，在db/db小鼠中檢測(cè)到Y(jié)THDC1, SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B的下調(diào)（Figure 8A,B）。并且db/db小鼠的創(chuàng)面愈合率明顯延遲（Figure 8C,D）。為了研究YTHDC1和SQSTM1在皮膚創(chuàng)面愈合中的功能作用，采用siRNA的策略敲除小鼠皮膚中的內(nèi)源性YTHDC1和SQSTM1基因（Figure 8E）。與WT-si-NC組相比，WT-si-Ythdc1組注射siRNA后YTHDC1、SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B蛋白表達(dá)水平下調(diào)(圖8F,G)。在WT-si-Sqstm1組中，與WT-si-NC組相比，注射si-Ythdc1組或si-Sqstm1組的SQSTM1和MAP1LC3B/LC3B蛋白表達(dá)水平都下調(diào)（Figure 8F,G）。還觀察到注射si-Ythdc1或si-Sqstm1的小鼠皮膚創(chuàng)面愈合延遲（Figure 8H,I）。以上表明，在體內(nèi)下調(diào)YTHDC1可減少小鼠角質(zhì)細(xì)胞SQSTM1表達(dá)和自噬并延遲傷口愈合。
圖8降低YTHDC1表達(dá)抑制角質(zhì)細(xì)胞的自噬和延遲糖尿病小鼠傷口愈合
參考文獻(xiàn)：
Liang Diefei., Lin Wei-Jye., Ren Meng., Qiu Junxiong., Yang Chuan., Wang Xiaoyi., Li Na., Zeng Tingting., Sun Kan., You Lili., Yan Li., Wang Wei.(2021). mA reader YTHDC1 modulates autophagy by targeting SQSTM1 in diabetic skin. Autophagy, undefined(undefined), 1-20. doi:10.1080/15548627.2021.1974175