SNRK對circ-SNRK的負(fù)反饋調(diào)節(jié)心肌梗死后心功能
心力衰竭（Heart failure，HF）作為一種慢性疾病威脅著人們的健康。作者認(rèn)為預(yù)防心肌梗死后心肌細(xì)胞(CMs)丟失的研究可能會降低HF的發(fā)生率，從SNRK(蔗糖非發(fā)酵1相關(guān)激酶，可增加心臟線粒體效率)中鑒定出一個與HF相關(guān)的circRNA ，circ-SNRK，并闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制。
技術(shù)路線：
主要結(jié)果：
采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立大鼠心衰模型，并通過超聲心動圖及心臟大體形態(tài)確保模型構(gòu)建成功(Fig. 1A)。根據(jù)超聲心動圖結(jié)果將大鼠分為對照組、補(bǔ)償(Comp)組、失代償性(Decomp)組。術(shù)后4周(Ctrl + Comp組)及6周(Decomp組)采集心臟，樣品處理后進(jìn)行高通量測序。在Ctrl vs Decomp和Comp vs Decomp分別篩選出923,1710個差異表達(dá)circRNA(fold change >2.0和p < 0.05)。此外，3組中存在507 個共有的circRNA，其中有498個circRNA在對照組和補(bǔ)償組表達(dá)豐度相似(Fig 1B)。將其進(jìn)行GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)其中有43個circRNA參與了缺血相關(guān)通路(Fig 1C)。最后，通過FACS實(shí)驗檢測細(xì)胞凋亡，circ-SNRK在心肌細(xì)胞中表現(xiàn)出相對高的表達(dá)，并且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)(Fig. 1D)。
圖1 circ-SNRK的鑒定
2. circ-SNRK的特性及其對心肌細(xì)胞的影響
Sanger測序及RNase R實(shí)驗證實(shí)了circ-SNRK存在于心肌細(xì)胞中(Fig. 2A–C)。作者還發(fā)現(xiàn)，circ-SNRK在不同的器官中均有表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中有殘基，且不隨年齡變化(Fig. 2D, E)。qRT-PCR顯示，circ-SNRK在衰竭大鼠心臟中顯著降低，這與RNA-seq數(shù)據(jù)一致。心臟缺血對心肌細(xì)胞的主要影響是會造成氧、葡萄糖不足。我們的數(shù)據(jù)顯示在低氧處理下的乳鼠心肌小鼠的線性SNRK(mRNA)和pre-SNRK (precursor mRNA) 呈先上升后下降的趨勢，而circ-SNRK僅呈下降趨勢。而低血糖(<1 g/L)對其無明顯影響(Fig. 2A/F)。
為進(jìn)一步研究其生理功能，作者分別用pGV486、siRNA來上調(diào)、下調(diào)circ-SNRK。Northern blot和RT-PCR結(jié)果顯示pGV486-circ-SNRK轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后可檢測circ-SNRK，只有circ-SNRK(而不是前SNRK或線性SNRK)被si-circ-SNRK下調(diào)。轉(zhuǎn)染后24 h，circ-SNRK 達(dá)到峰值(~25%)，且其降解率低于線性SNRK。此外，我們發(fā)現(xiàn)circ-SNRK可以增加能量產(chǎn)生(Fig. 2G–I)，能改善細(xì)胞凋亡，但對細(xì)胞自噬和焦亡無明顯作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，circ-SNRK能通過SNRK蛋白作為能量調(diào)節(jié)器抑制細(xì)胞凋亡，于是作者主要關(guān)注其生理功能。
Fig2心肌細(xì)胞中circ-SNRK的特點(diǎn)及其影響
3. MiR-33通過SNRK介導(dǎo)circ-SNRK與ATP合成
之前在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)circ-SNRK的殘基，暗示它可能通過其翻譯的多肽或作為miRNAs海綿發(fā)揮其功能。在發(fā)現(xiàn)它包含一個開放閱讀框后，作者將重構(gòu)的帶有His標(biāo)簽的circ-SNRK克隆到pGV486中。線性化ORF加上His標(biāo)簽作為陽性控制。免疫印跡和免疫染色均未觀察到肽(~32 kDa)，提示circ-SNRK在心肌細(xì)胞中不能轉(zhuǎn)化為肽。
接下來，作者推測miR-33可能是circ-SNRK的靶向的基因(Fig 3A)。雙熒光素酶報告基因和FISH檢測證實(shí)circ-SNRK可直接與miR-33結(jié)合(Fig. 3B)。同時，我們對AGO2進(jìn)行RIP檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，circ-SNRK表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步表明circ-SNRK可直接與miR-33 結(jié)合(Fig. 3C)。
接下來，作者發(fā)現(xiàn)miR-33可以降低心肌細(xì)胞中ATP和金屬蛋白酶（MMP）的合成，而miR-33抑制劑則有相反的作用(Fig. 3D)。此外，mut-circ-SNRK(沒有miR-33結(jié)合位點(diǎn))對ATP合成和MMP的影響與pGV486-NC相似，而circ-SNRK的降低作用能被miR-33抑制劑挽救（Fig. 3E）。這些結(jié)果表明，miR-33介導(dǎo)circ-SNRK影響心肌細(xì)胞。
接下來，作者檢測了circ-SNRK是否通過SNRK調(diào)節(jié)能量代謝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠中，circ-SNRK過表達(dá)會增加SNRK蛋白，circ-SNRK低表達(dá)會降低的SNRK蛋白的表達(dá)。同時， circ-SNRK引起的SNRK上調(diào)可以通過miR-33改善，而miR-33抑制劑可以挽救降低的SNRK。因此，circ-SNRK通過miR-33影響SNRK表達(dá)。然后，將缺氧處理的小鼠心肌細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)染pGV486-circ- SNRC和si-SNRK或者si-circ-SNRK 和Ad-SNRK，作者發(fā)現(xiàn)，circ-SNRK過表達(dá)對ATP產(chǎn)生的影響被SNRK敲低所抑制，而circ-SNRK低表達(dá)的影響被SNRK過表達(dá)所回避(Fig. 3G)。說明circ-SNRK可以通過受miR-33 -SNRK軸，進(jìn)而影響ATP合成。
Fig3 MiR-33通過SNRK連接環(huán)狀SNRK與ATP合成
4. NOVA1促進(jìn)circ-SNRK的形成，并直接與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合
鑒于miR-33可以提高circ-SNRK水平，而蛋白SNRK是miR-33的靶點(diǎn)，推測SNRK可能影響circ-SNRK的環(huán)化形成。qRT-PCR結(jié)果顯示，在心肌細(xì)胞中，circ-SNRK被si-SNRK上調(diào)，被Ad-SNRK下調(diào)，暗示SNRK在circ-SNRK的形成中起作用。
考慮到SNRK與circ-SNRK呈反向變化模式，它不應(yīng)該直接連接到pre-circ-SNRK上，因為直接的相互作用會增加circ-SNRK的形成。為了識別連接SNRK和circ-SNRK的蛋白，通過側(cè)翼分析找到3個可能連接SNRK和circ-SNRK的RNA結(jié)合蛋白。進(jìn)一步檢測，qRT-PCR結(jié)果顯示，只有si-NOVA1能降低Lnc-SNRK水平(圖4 b)。此外，我們檢測到在心肌細(xì)胞中過表達(dá)NOVA1會提高circ-SNRK表達(dá)水平 (圖4C)。以上結(jié)果表明，與SNRK蛋白不同，NOVA1可以促進(jìn)circ-SNRK的形成。
通過分析pre-circ-SNRK的側(cè)翼內(nèi)含子，作者在5 '內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了1個NOVA1的潛在結(jié)合位點(diǎn)，在3 '內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了3個NOVA1的潛在結(jié)合位點(diǎn)(Fig 4 d)。為了驗證相互作用，作者使用NOVA1的RIP，檢測了所有預(yù)測位點(diǎn)的序列(Fig 4E)。用生物素標(biāo)記的RNA作為誘餌，檢測是否可以拉下NOVA1，結(jié)果所有位點(diǎn)均顯示陽性結(jié)果(Fig 4F)。表明NOVA1可以綁定到pre-circ-SNRK側(cè)翼，并對circ-SNRK有影響。
為了解NOVA1是否影響circ-SNRK的形成，作者將帶有NOVA1結(jié)合位點(diǎn)(wt或mut)的pre-circ-SNRK克隆到質(zhì)粒(pCMV-wt-pre-circ-SNRK, pCMV-mut-pre-circ-SNRK)中，然后將其轉(zhuǎn)染到si-NOVA1處理過的HEK293中。兩種情況下均未觀察到circ-SNRK。然而，NOVA1過表達(dá)僅挽救了轉(zhuǎn)染了pCMV-wt-pre-circ-SNRK的HEK293的circ-SNRK，提示了NOVA1在circ-SNRK形成中的必要性(Fig. 4G)。
在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中觀察NOVA1結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了NOVA1有超過兩個相似的RNA結(jié)合基序。此外，native PAGE的結(jié)果顯示，NOVA1可以在NRCMs中形成二聚體(圖4H)。于是推斷NOVA1具有促進(jìn)circ-SNRK形成的能力。最后，作者發(fā)現(xiàn)蛋白NOVA1在缺氧狀態(tài)下沒有明顯變化，提示NOVA1在上述情況下能夠發(fā)揮其功能(Fig. 4I)。
Fig. 4 NOVA1促進(jìn)circ-SNRK的形成，并直接與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合
5. SNRK的55 kDa肽段能與NOVA1連接并影響circ-SNRK的形成
通過qRT-PCR實(shí)驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NOVA1可以挽救circ-SNRK的下降，而Ad-SNRK的低表達(dá)則有相反的作用，提示SNRK通過NOVA1影響circ-SNRK的形成（Fig 5A）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NOVA1 mRNA不受SNRK蛋白的影響（Fig 5B）。接下來進(jìn)行SNRK的免疫共沉淀實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)NOVA1被下拉（Fig 5C），NOVA1的下拉肽分子量為55 kDa，可被SNRK抗體所識別，說明它是SNRK蛋白的一部分（Fig 5D）。構(gòu)建pCMV-N-His-SNRK和pCMV-SNRK-C-His探索其肽端，通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分別發(fā)現(xiàn)了約30 kDa和55 kDa肽段（Fig 5E），進(jìn)一步分析SNRK的結(jié)構(gòu)（Fig 5F），最終發(fā)現(xiàn)這個55kDa的肽段屬于SNRK的C端。
已有研究表明，SNRK與細(xì)胞死亡有關(guān)，兩個結(jié)構(gòu)域的連接包含Asp殘基(Caspases的底物)，這都表明SNRK可能被Caspases降解。用Z-vad (Caspases的全局抑制劑)培養(yǎng)NRCMs 48小時，發(fā)現(xiàn)其55kda肽顯著下調(diào)(Fig 5G)，進(jìn)一步利用SNRK作為誘餌來鑒定哪些Caspase (Caspase 3/6/7)在這里發(fā)揮作用，發(fā)現(xiàn)只有Caspase 3參與其中和SNRK結(jié)合(Fig. 5H)。最后，作者通過 si-Caspase 3降低了NRCMs中的Caspase 3，發(fā)現(xiàn)55kda肽水平隨時間的增加而降低；然而，整體SNRK增加(圖5I)。綜上所述，SNRK可以被激活的Caspase 3降解分為兩個肽段，其中的55kda肽段直接與NOVA1相互作用。
此外，在Z-vad處理后，將pCMV-SNRK或pCMV-55kDa轉(zhuǎn)染新生大鼠心肌細(xì)胞48小時，探索55kDa肽能否影響circ-SNRK的形成，qRT-PCR顯示circ-SNRK僅受55 kDa肽影響（Fig 5J）。免疫熒光實(shí)驗顯示C端肽位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而N端肽僅殘基在細(xì)胞質(zhì)中，表明只有55 kDa肽能進(jìn)入細(xì)胞核（Fig 5K）。研究SNRK如何調(diào)節(jié)NOVA1對circ-SNRK形成的影響，用放線菌素D處理在NACM中上調(diào)或下調(diào)55 kDa肽，發(fā)現(xiàn)NOVA1蛋白沒有明顯變化，提示55 kDa肽對NOVA1的穩(wěn)定性沒有影響（圖5L）。轉(zhuǎn)染和qRT-PCR實(shí)驗推測NOVA1與55 kDa肽的相互作用可以抑制NOVA1與內(nèi)含子的結(jié)合（Fig 5M）。綜上實(shí)驗表明SNRK通過NOVA1影響circ-SNRK的形成。
圖5 SNRK的55 kDa肽段能與NOVA1連接并影響環(huán)狀SNRK的形成
6. 缺氧通過NF-κB通路增加SNRK的轉(zhuǎn)錄
低氧誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞內(nèi)SNRK、線性SNRK和circ-SNRK 的變化。為了闡明其機(jī)制，于是作者對缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，包括HIF(低氧誘導(dǎo)因子)、NF-κB(核因子NF-kappa- b)或AP-1(激活蛋白-1)。分別通過抑制劑進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)僅在JSH-23處理下，缺氧條件下的心肌細(xì)胞pre-SNRK顯著降低(Fig. 6A)。此外，生物信息分析提示在SNRK的啟動子中NF-κB有三個可能的結(jié)合位點(diǎn)(Fig. 6B)。因此，作者推測缺氧可能通過NF-κB通路影響SNRK轉(zhuǎn)錄。然后，利用NF-κB復(fù)合體中最豐富的元素pCMV-P65上調(diào)P65水平。
免疫熒光顯示在pCMV-P65轉(zhuǎn)染的新生大鼠心肌細(xì)胞中，P65的核表達(dá)增加（Fig.6C）。新生大鼠心肌細(xì)胞中pre-SNRK的顯著增加表明NF-κB復(fù)合物可以激活SNRK轉(zhuǎn)錄(Fig 6D)；在si-P65轉(zhuǎn)染的新生大鼠心肌細(xì)胞中pre-SNRK的減少進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)（Fig 6E）。接下來，作者針對預(yù)測位點(diǎn)在P65啟動子中設(shè)計了三種引物 (Fig 6B)。采用染色質(zhì)免疫沉淀法檢測P65的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以檢測到第二個位點(diǎn)的序列(Fig 6F)。作者進(jìn)一步將SNRK的wt或mut啟動子克隆到pGL4.27載體中，顯示心肌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pCMV-P65和pGL 4.27-wt-SNRK啟動子的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組(Fig. 6G)。最后，發(fā)現(xiàn)在缺氧治療的心肌細(xì)胞或心肌梗死后P65升高，表明pre-SNRK過表達(dá)與心臟中的P65相關(guān)(Fig.6 h)。綜上所述，缺氧可以通過NF-κB通路激活SNRK轉(zhuǎn)錄。
圖6 缺氧通過NF-κB通路促進(jìn)SNRK的轉(zhuǎn)錄
7. Circ-SNRK改善心肌梗死大鼠心功能
作者接下來研究了circ-SNRK是否能在體內(nèi)改善心肌梗死后心功能。通過病毒載體(AAV9)建立了過表達(dá)（MI-circ-SNRK 組）或不表達(dá)circ-SNRK (MI對照組)的HF大鼠模型。qRT-PCR結(jié)果顯示MI-circ-SNRK組circ-SNRK顯著上調(diào)(Fig 7A)。三色染色顯示SNRK組心肌梗死面積顯著降低(Fig 7B)。MI-circ-SNRK組超聲心動圖指標(biāo)(LVEF、FS、LVPW)均較高，提示circ-SNRK過表達(dá)大鼠心功能較好(Fig 7C, D)。MI-circ-SNRK組ATP和ATP/ADP比值的升高表明其在能量代謝中的有益作用(Fig 7E,F)。Caspase 3/Parp-1免疫印跡和Tunel實(shí)驗表明circ-SNRK可以改善細(xì)胞在體內(nèi)的死亡(Fig 7G-H)。研究circ-SNRK在體內(nèi)是否通過SNRK發(fā)揮其功能，研究數(shù)據(jù)顯示SNRK和相關(guān)蛋白的表達(dá)與預(yù)期一致且不同組間miR-33無變化，這些與體外實(shí)驗結(jié)果一致（Fig 7I-J）。這些結(jié)果表明circ-SNRK可以通過miR-33 -SNRK軸保護(hù)心臟免于能量耗盡，進(jìn)而改善心肌梗死后的心功能。
Fig. 7 Circ-SNRK可改善大鼠心肌梗死后心功能
circ-SNRK與SNRK的負(fù)循環(huán)調(diào)節(jié)了能量代謝，可能是治療心力衰竭的一個潛在靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)： Wang ZY, Liu XX, Deng YF. Negative feedback of SNRK to circ-SNRK regulates cardiac function post-myocardial infarction. Cell Death Differ 2021.