腦出血后CCR5激活通過CCR5/PKA/CREB途徑促進(jìn)NLRP1依賴性神經(jīng)元焦亡

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-12-29
目前有研究探討了實(shí)驗(yàn)性腦出血(ICH)后CCR5激活對(duì)神經(jīng)元焦亡的影響以及涉及cAMP依賴的PKA /CREB /NLRP1通路的潛在機(jī)制......


   神經(jīng)元性焦亡是一種由促炎信號(hào)觸發(fā)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。
CCR5C-C趨化因子受體5)介導(dǎo)的炎癥參與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。目前有研究探討了實(shí)驗(yàn)性腦出血(ICH)后CCR5激活對(duì)神經(jīng)元焦亡的影響以及涉及cAMP依賴的PKA /CREB /NLRP1通路的潛在機(jī)制。該研究202111月發(fā)表在《Stroke》,IF7.9.


技術(shù)路線:

主要研究結(jié)果:

1.  腦出血后腦內(nèi)CCR5的時(shí)空表達(dá)

采用ELISAWestern blot檢測(cè)腦出血后0、3、6、12、2472小時(shí)同側(cè)(右側(cè))大腦半球CCL5、CCR5、PKACα、p-CREBNLRP1的表達(dá)。與Sham組相比,在3小時(shí)時(shí)檢測(cè)到CCL5水平顯著升高,經(jīng)ELISA測(cè)定,24小時(shí)時(shí)CCL5水平相對(duì)較高。CCR5水平在腦出血后3小時(shí)顯著升高,在24小時(shí)達(dá)到峰值,并在72小時(shí)開始下降(圖1A)。腦出血后,CCR5的潛在下游蛋白PKACαp-CREB也以與CCR5相似的模式暫時(shí)升高。與Sham組相比,腦出血后6小時(shí)NLRP1炎癥體表達(dá)顯著上調(diào),72小時(shí)達(dá)到峰值(圖1A)。雙免疫熒光染色顯示腦出血后24小時(shí)CCR5主要表達(dá)于同側(cè)基底皮質(zhì)的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞(1B)

1  ICHCCL5、CCR5、PKA-Cα、p-CREB、CREBNLRP1蛋白水平的時(shí)空表達(dá)


2.  
MVC抑制CCR5可減輕腦出血后2472小時(shí)的神經(jīng)行為缺陷

ICH24小時(shí),與Sham組相比,ICH+vehicle組有明顯的神經(jīng)損傷(圖2A)。與載體治療ICH組相比,每天150450 μg/kg劑量的MVC治療在ICH24小時(shí)的改良Garcia試驗(yàn)、前肢放置試驗(yàn)和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)中顯著改善了神經(jīng)功能(圖2A)。

根據(jù)這一結(jié)果,確定150μg/kg/天的劑量為MVC的最佳劑量,并在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用。與ICH+載體組相比,在ICH72小時(shí),MVC治療顯著降低ICH小鼠的神經(jīng)行為缺陷(圖2B)。相反,與ICH+載體組相比,ICH72小時(shí)首次給藥MVC并沒有顯著減少ICH小鼠的神經(jīng)行為缺陷(圖2C)。

2 MVC對(duì)ICH2472小時(shí)神經(jīng)行為結(jié)果的影響


3.  
MVC介導(dǎo)的CCR5抑制降低了腦出血后24小時(shí)內(nèi)神經(jīng)元焦亡細(xì)胞的死亡

TUNEL染色和Fluoro-Jade C染色分別用于評(píng)估MVC治療是否減少了神經(jīng)細(xì)胞死亡。在腦出血24小時(shí)后,用cleaved caspase-1標(biāo)記的神經(jīng)元核來評(píng)估神經(jīng)元焦亡。腦出血后24小時(shí),Sham組相比,腦出血大鼠的TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元和Fluoro-Jade C陽(yáng)性變性神經(jīng)元顯著增加(圖3A3B)。MVC介導(dǎo)的CCR5抑制顯著減少TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元和Fluoro-Jade C陽(yáng)性退化神經(jīng)元數(shù)量(圖3A3B)。與ICH+治療組相比,在ICH24小時(shí),MVC治療顯著減少了血腫周圍區(qū)域cleaved caspase-1陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量(圖3C)。

3 ICH24小時(shí),用MVC抑制CCR5對(duì)神經(jīng)元損傷、焦亡的影響


4.  
MVC改善了腦出血后的長(zhǎng)期感覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、空間學(xué)習(xí)和參考記憶功能,并減少了海馬氨角1CA1)神經(jīng)元的丟失

Sham組相比,ICH+載體組在足部缺陷試驗(yàn)中有更多的左前肢足部缺陷,在ICH后的第一、第二和第三周,在rotarod試驗(yàn)中下降的潛伏期更短(圖4A)。而MVC治療顯著減少了左側(cè)前肢的足部缺陷(圖4A),但增加了ICH小鼠的下降潛伏期(圖4A)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,ICH+載體組的游泳距離和逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于Sham組。然而,與ICH+載體組相比,MVC治療顯著降低了第3-5區(qū)的逃避潛伏期和游泳距離(圖4A)。在探測(cè)象限試驗(yàn)中,與Sham組相比,ICH+載體組在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間更少。然而,與ICH+載體組相比,MVC治療顯著增加了在探測(cè)象限花費(fèi)的時(shí)間(圖4A)。在ICH后第25天進(jìn)行Nissl染色以評(píng)估海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元丟失。結(jié)果顯示,ICH+載體組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量少于Sham組,但與ICH+載體組相比,MVC治療顯著增加了存活的CA1神經(jīng)元數(shù)量(圖4B)。

4 MVC改善了ICH后的長(zhǎng)期神經(jīng)行為功能


5.  
腦出血后24小時(shí),CREB抑制劑逆轉(zhuǎn)MVC對(duì)神經(jīng)行為缺陷和CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1介導(dǎo)的焦亡的神經(jīng)保護(hù)作用

ICH24小時(shí),用CREB抑制劑666-15預(yù)處理,可顯著逆轉(zhuǎn)MVC對(duì)改良Garcia、前肢放置和轉(zhuǎn)角測(cè)試的神經(jīng)行為益處(圖5A)。此外,MVC顯著增加同側(cè)腦出血后腦組織中PKA-Cαp-CREB的蛋白水平,但降低NLRP1、ASC、C-caspase-1N-GSDMD、IL-1βIL-18的表達(dá)(圖5B)。與MVC治療的ICH小鼠相比,666-15一致逆轉(zhuǎn)了MVC對(duì)細(xì)胞死亡和CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路的影響,這與NLRP1、ASCC-caspase-1、N-GSDMD、IL-1βIL-18的蛋白水平升高有關(guān)(圖5B)。

5 666-15對(duì)CREB的抑制消除了MVC對(duì)ICH小鼠的神經(jīng)功能益處和抗神經(jīng)性過敏作用


6.  
在注射rCCL524小時(shí),通過rCCL5激活CCR5,通過CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路導(dǎo)致幼稚小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損和焦亡

側(cè)腦室注射rCCL5顯著降低了幼稚小鼠改良Garcia、肢體放置和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)的神經(jīng)評(píng)分(圖6A),并導(dǎo)致同側(cè)腦組織中NLRP1、ASC、C-caspase-1N-GSDMD、IL-1βIL-18的蛋白水平顯著升高(圖6B)。相反,與naive + rCCL5 +載體組相比,PKA激活劑8--cAMP通過顯著增加na?ve + rCCL5 + 8-Bromo-cAMPPKA-Cα的表達(dá),逆轉(zhuǎn)了rCCL5的作用(圖6B)。

6 rCCL5通過激活CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號(hào)通路對(duì)幼稚小鼠的有害影響


主要結(jié)論:

該研究表明,小鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后,CCR5激活至少部分通過CCR5/PKA/CREB信號(hào)通路促進(jìn)NLRP1依賴性神經(jīng)元焦亡和神經(jīng)功能缺損。使用MVC抑制CCR5可能在ICH患者的治療中提供一種有希望的治療策略。


參考文獻(xiàn):

Yan J, Xu W, Lenahan C, Huang L, Wen J, Li G, Hu X, Zheng W, Zhang JH, Tang J. CCR5 Activation Promotes NLRP1-Dependent Neuronal Pyroptosis via CCR5/PKA/CREB Pathway After Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 2021, 52(12):4021-4032. doi: 10.1161/STROKEAHA.120.033285.