M6A RNA甲基化介導(dǎo)的RMRP穩(wěn)定性通過(guò)調(diào)控TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路實(shí)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的增殖

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在全球所有惡性腫瘤中死亡率最高。長(zhǎng)鏈非編碼 (lncRNAs)在癌癥進(jìn)展中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。鑒于RMRP對(duì)致瘤性的潛在調(diào)控作用，作者進(jìn)一步研究RMRP在NSCLC中的的機(jī)制究。

技術(shù)路線： 

主要結(jié)果：

1. RMRP可能是NSCLC的一種生物標(biāo)志物

作者首先對(duì)癌癥基因組圖譜進(jìn)行了綜合分析，TCGA肺腺癌(LUAD)數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，RMRP在NSCLC組織中的表達(dá)高于正常組織(Fig.1A)。RMRP高表達(dá)與T分期晚期和較差的生存率相關(guān)(Fig.1B,C)。此外，GSE43458數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與正常肺組織相比，RMRP在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)比較 (Fig.1D)。

共表達(dá)研究是探索基因潛在功能的一種途徑。作者研究了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中與RMRP共同表達(dá)的mRNA(cor > 0.4, p < 0.01)。GO結(jié)果表明，RMRP在蛋白質(zhì)異二聚活性、染色質(zhì)DNA結(jié)合、苦味受體活性等方面發(fā)揮作用(Fig.1E)。KEGG結(jié)果顯示，RMRP在酒精中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、病毒致癌、轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路中富集(Fig. 1F)。

然后進(jìn)行KEGG研究的基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)。RMRP在細(xì)胞周期、結(jié)直腸癌、蛋白出口、TGFB通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路中富集(Fig. 1G)。這些通路與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示RMRP可能在NSCLC中發(fā)揮重要作用。研究表明，RMRP不具有蛋白質(zhì)編碼潛力(Fig. 1H, I)。

Fig 1：NSCLC的綜合分析表明lncRNA-RMRP是NSCLC患者潛在的分子標(biāo)記物

2. m⁶A修飾在RMRP中富集，提高了RMRP轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性

最近的初步研究報(bào)道，m6A的修飾廣泛存在，它調(diào)控轉(zhuǎn)錄組，影響RNA的剪接、翻譯、輸出、定位和穩(wěn)定性。為了探究RMRP的m6A修飾，首先使用在線生物信息學(xué)工具m6Avar (http://m6avar.renlab.org/)預(yù)測(cè)了位于RMRP中的m6A位點(diǎn)，并確定了兩個(gè)RMRP m6A序列基序。

然后，在人正常肺上皮細(xì)胞(HBE)和兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549和H1299)中進(jìn)行甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)檢測(cè)。MeRIP-qPCR檢測(cè)顯示，HBE細(xì)胞系列中RMRP m6A甲基化水平低于NSCLC細(xì)胞(A549和H1299)(Fig 2A)。隨后我們使用了小RNA干擾m6A甲基化酶復(fù)合物的核心組分METTL3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞系中m6A水平在總RNA和RMRP中均有降低了 (Fig 2,B, C, D)。在A549細(xì)胞中，用放線菌素D (5 μg/mL)阻斷新RNA合成后，檢測(cè)RMRP RNA的丟失。結(jié)果顯示，下調(diào)METT3后，RMRP的RNA穩(wěn)定性降低(Fig. 2E)。

此外，下調(diào)METT3后，miR-122或miR-206的表達(dá)增加，在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RMRP后，miR-122或miR-206的表達(dá)可被挽救。而METTL3過(guò)表達(dá)降低了H1299細(xì)胞中miR-122或miR-206的表達(dá)。以上結(jié)果提示，與肺正常上皮細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞中RMRP的m6A水平上調(diào)，m6A的修飾可能提高了RMRP轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，這可能是NSCLC中RMRP顯著上調(diào)的原因之一。

Fig 2  NSCLC細(xì)胞中RMRP的m⁶A水平較高

3. RMRP促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步探討RMRP的作用，我們采用定量RT-PCR方法檢測(cè)了RMRP在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。RMRP在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于H1299細(xì)胞系(Fig. 3A)。隨后，作者在A549細(xì)胞系中通過(guò)兩種不同的短發(fā)卡結(jié)構(gòu)（shRMRP-1和shRMRP-2）轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)RMRP干擾，同時(shí)將RMRP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。通過(guò)定量驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（Fig.3B,C）。CCK-8和菌落形成實(shí)驗(yàn)表明，shRMRP轉(zhuǎn)染的NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)染RMRP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖受到相反的影響(Fig. 3D–G)。

Fig 3 RMRP促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖

4. TGFBR1是RMRP促進(jìn)增殖、入侵和遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示TGFBR1與RMRP的表達(dá)呈正相關(guān)(Fig 4A)。因此，作者假設(shè)RMRP可能針對(duì)TGFBR1。于是在A549或H1299細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)RMRP，TGFBR1的表達(dá)量隨之變化(Fig. 4B, C)。

此外，在A549細(xì)胞系中敲低RMRP，TGFBR1表達(dá)降低，BAX/bcl - 2增加，而TGFBR1過(guò)表達(dá)則相反。在H1299細(xì)胞中，RMRP過(guò)表達(dá)后，TGFBR1的表達(dá)增加，BAX/Bcl-2的表達(dá)減少，而TGFBR1敲除后則相反(Fig. 4D)。

此外，作者進(jìn)一步探討TGFBR1參與RMRP促進(jìn)NSCLC生長(zhǎng)和增殖的機(jī)制。結(jié)果表明， shRMRP對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用通過(guò)TGFBR1過(guò)表達(dá)得到了緩解，而TGFBR1敲除后則發(fā)現(xiàn)相反的作用(Fig. 4E, F, H, J)。

接下來(lái)，我作者探討了RMRP對(duì)侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)展的影響。創(chuàng)傷愈合、transwell和細(xì)胞周期檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染shRMRP的NSCLC細(xì)胞的侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)展明顯受到抑制，而在RMRP過(guò)表達(dá)細(xì)胞中觀察到相反的作用。此外，shRMRP對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲、遷移和G1細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制在TGFBR1過(guò)表達(dá)后被挽救，而在TGFBR1敲除后觀察到相反的作用(Fig. 4G, I, K, L, M, N)。這些結(jié)果表明，TGFBR1可能是RMRP促進(jìn)增殖、入侵和遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Fig 4 TGFBR1是RMRP促進(jìn)增殖、入侵和遷移的關(guān)鍵靶點(diǎn)

5. RMRP與轉(zhuǎn)錄因子YBX1相互作用

為了進(jìn)一步闡明RMRP的機(jī)制，作者在NSCLC細(xì)胞中進(jìn)行了核和細(xì)胞質(zhì)RNA的分離和熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)。結(jié)果表明，RMRP主要位于細(xì)胞質(zhì)中(Fig 5A,B)。最近的一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNAs通過(guò)與DNA或蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮功能。作者使用catRAPID探索RMRP的調(diào)控作用。結(jié)果表明，YBX1是RMRP潛在的結(jié)合蛋白，在NSCLC中起重要作用(Fig 5C)。RIP檢測(cè)結(jié)果顯示，抗YBX1抗體顯著富集RMRP(Fig 5D,E)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了RMRP與YBX1之間的相互作用(Fig. 5F)。總之，YBX1與RMRP之間存在密切的相互作用。

Fig 5 RMRP與轉(zhuǎn)錄因子YBX1相關(guān)

6. RMRP通過(guò)將YBX1招募到TGFBR1啟動(dòng)子來(lái)促進(jìn)TGFBR1的轉(zhuǎn)錄

接下來(lái)，通過(guò)研究TCGA-LUAD的ATAC-seq數(shù)據(jù)來(lái)確定TGFBR1可能的轉(zhuǎn)錄因子。該分析顯示TGFBR1基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)YBX1的潛在結(jié)合序列。對(duì)TCGA-LUAD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析顯示，YBX1的表達(dá)與TGFBR1呈正相關(guān)，與RMRP1無(wú)關(guān)(Fig. 6A–C)。因此，作者推測(cè)YBX1作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，可能被RMRP招募到TGFBR1啟動(dòng)子中。接下來(lái)，分別將SiYBX1、pcDNAYBX1及其對(duì)照 SiNC、Ctrl分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)敲低YBX1會(huì)抑制TGFBR1的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)YBX1促進(jìn)了TGFBR1的表達(dá)(Fig. 6D)。

YBX1結(jié)合復(fù)合物顯著富集TGFBR1啟動(dòng)子(Fig. 6E,F)，在野生型TGFBR1 (TGFBR1- wt)的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)YBX1增加了熒光素酶活性，而在表達(dá)突變型TGFBR1 (TGFBR1- mut)的細(xì)胞中沒(méi)有增加熒光素酶活性（Fig. 6G,H）。RMRP的敲低降低了YBX1在 TGFBR1啟動(dòng)子上的富集，而這種作用通過(guò)共轉(zhuǎn)染YBX1的 被逆轉(zhuǎn)(Fig. 6I)。此外，RMRP還加強(qiáng)了結(jié)合能力(Fig. 6J)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了熒光素酶活性的變化是由于抑制或過(guò)表達(dá)RMRP引起的(Fig.6K.L)。

     Fig 6 RMRP通過(guò)將YBX1招募到TGFBR1啟動(dòng)子來(lái)促進(jìn)TGFBR1的轉(zhuǎn)錄

7. RMRP調(diào)控TGFBR1/SMAD2/ SMAD3通路

Western blot和免疫熒光分析顯示，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，RMRP基因敲除顯著抑制了p-SMAD2/3的核轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)（Fig7A,B）。為進(jìn)一步探討RMRP是否可以通過(guò)調(diào)控TGFBR1轉(zhuǎn)錄外的其他方式影響TGFB信號(hào)傳導(dǎo)，作者在NSCLC細(xì)胞中TGFBR1進(jìn)行敲低處理，Western blot結(jié)果顯示，RMRP的改變對(duì)siTGFBR1組中p-SMAD2和p-SMAD3的表達(dá)水平?jīng)]有影響，說(shuō)明TGFBR1在激活SMAD2/SMAD3信號(hào)通路中是不可或缺的(Fig. 7C)。TGFB通路通常與CSC特性和EMT相關(guān)。因此，作者探討了RMRP是否促進(jìn)了NSCLC中CSC的性質(zhì)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)CSC相關(guān)基因（KLF4，SOX2、NANOG、CD133、ALDH）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中，RMRP敲低后這些基因的表達(dá)都降低了。而在H1299細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RMRP后，這些基因表達(dá)上調(diào)(Fig. 7D)。

此外，作者還探索了這些細(xì)胞中的EMT相關(guān)基因。結(jié)果顯示，RMRP敲除增加了E-鈣粘蛋白的表達(dá)，降低了N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá) (Fig. 7A)。此外，我們還研究了這些細(xì)胞的成球能力。結(jié)果表明，敲低RMRP的表達(dá)降低了成球能力，而過(guò)表達(dá)RMRP增加了這種能力(Fig. 7E)。

此外，RMRP抑制增加了A549細(xì)胞對(duì)順鉑和放療的敏感性(Fig. 7F,G)。這些數(shù)據(jù)表明，RMRP通過(guò)增強(qiáng)CSC的自我更新和EMT促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。

Fig 7 RMRP調(diào)控NSCLC中TGFBR1/SMAD2/ SMAD3通路

8. RMRP的下調(diào)限制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步證實(shí)RMRP在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，將A549-shRMRP細(xì)胞和a549 - scramble細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)。30天后，shRMRP組腫瘤明顯變小(Fig. 8A、B)，在shRMRP中，腫瘤體積和重量明顯降低(Fig. 8C, D)。此外，A549 -Scrambled組中Ki-67、MMP9和TGFBR1的表達(dá)量較高（Fig. 8E）。

Fig8 RMRP的下調(diào)限制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)

   本研究中，作者發(fā)現(xiàn)研究表明，m6A RNA甲基化介導(dǎo)的RMRP的穩(wěn)定性通過(guò)調(diào)控TGFBR1 / SMAD2 / SMAD3通路實(shí)現(xiàn)了NSCLC的增殖和進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

Yin, H., et al., M6A RNA methylation-mediated RMRP stability renders proliferation and progression of non-small cell lung cancer through regulating TGFBR1/SMAD2/SMAD3 pathway. Cell Death Differ, 2021.