新思路——鐵死亡依賴的巨噬細(xì)胞外泌體通過運(yùn)載鐵蛋白促進(jìn)間皮癌變
石棉誘導(dǎo)的相關(guān)疾病仍然是世界范圍內(nèi)的社會(huì)負(fù)擔(dān)。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，石棉誘導(dǎo)的間皮細(xì)胞富含鐵，并有不斷的巨噬細(xì)胞鐵死亡。然而，這種誘變環(huán)境如何影響間皮細(xì)胞的分子機(jī)制尚未闡明。這里，作者提出了一個(gè)新的機(jī)制：鐵死亡的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)石棉相關(guān)的間皮細(xì)胞突變。隨后作者通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該猜想。本文于2021年10月發(fā)表在《Redox Biology》IF：11.799雜志上。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、鐵死亡依賴的細(xì)胞外囊泡（FedEVs）在石棉誘發(fā)的誘變環(huán)境中凝聚
首先進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，使用小鼠腹膜注射青石棉注射模型來闡明FedEVs在石棉誘導(dǎo)的肉芽腫瘤中的組織定位。在石棉注射6個(gè)月后，觀察到慢性肉芽腫性腹膜炎是由于異物與過量的鐵的反應(yīng)，類似于作者之前的報(bào)道(Fig. 1ad)。免疫熒光分析顯示，石棉纖維存在于CD68陽性的巨噬細(xì)胞內(nèi)，而不存在于α- SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞和間皮陽性的間皮細(xì)胞中(Fig. 1a)。值得注意的是，EV的標(biāo)記物CD63在肉芽腫附近的間皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中呈顆粒狀顯著富集(Fig. 1bc)。作者之前報(bào)道，在石棉誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡在富鐵環(huán)境下鐵死亡是主要形式。因此，作者推測(cè)是否是鐵死亡導(dǎo)致巨噬細(xì)胞EV分泌增加。CD63的WB分析顯示，加入GPX4抑制劑RSL-3（即鐵死亡誘導(dǎo)劑）后，HT1080細(xì)胞分泌EV顯著增加(Fig. 1ef)。類似地，石棉暴露的富鐵環(huán)境下的THP1巨噬細(xì)胞，增加了EV的產(chǎn)生和分泌(Fig. 1gh)。此外，通過納米跟蹤分析(NTA)發(fā)現(xiàn)，在富鐵條件下，青石棉石暴露時(shí)EV數(shù)量增加最多(圖1kl)，其直徑為150 nm，峰值在250 nm和350 nm處發(fā)生位移(圖1ij)。這些結(jié)果表明石棉依賴的巨噬細(xì)胞鐵死亡是和EV分泌直接相關(guān)的，石棉誘導(dǎo)的肉芽腫是FedEVs的一種輸出基質(zhì)。
圖1 CD63陽性的FedEVs在石棉誘發(fā)的誘變環(huán)境中凝聚
2、間皮細(xì)胞內(nèi)化FedEVs
接下來探究間皮細(xì)胞內(nèi)化FedEVs的可能性。構(gòu)建GFP-CD63穩(wěn)定過表達(dá)的THP1和HT1080細(xì)胞系，作為FedEVs供體細(xì)胞（Fig. 2a）。將GFP標(biāo)記的FedEVs加入MeT-5A間皮細(xì)胞后，在受體MeT-5A細(xì)胞的質(zhì)膜上觀察到來自供體細(xì)胞的GFP-CD63，從0.5 h開始，持續(xù)到3 h，形成泡狀結(jié)構(gòu)。在6 ~ 9小時(shí)后，F(xiàn)edEVs被受體間皮細(xì)胞完全內(nèi)化，從GFP-CD63和內(nèi)源性CD63共存的細(xì)胞質(zhì)可以看出(Fig. 2bc)。然后，評(píng)估了在24小時(shí)內(nèi)，間皮細(xì)胞中催化Fe(II)的含量，通過FACS分析顯示，細(xì)胞內(nèi)催化Fe(II)的含量顯著增加(Fig. 2d-g)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)edEVs可能將鐵從鐵死亡的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到間皮細(xì)胞。
圖2間皮細(xì)胞內(nèi)化FedEVs
3、FedEVs以鐵蛋白為主要成分
為了全面鑒定FedEVs中的蛋白質(zhì)成分，使用LC-MS進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。從暴露于鐵和/或青石棉96小時(shí)的巨噬細(xì)胞分泌的FedEVs中提取蛋白質(zhì)。將差異表達(dá)蛋白(未處理vs青石棉和鐵處理)整合為蛋白質(zhì)圖譜圖像，涵蓋整個(gè)項(xiàng)目并列出前15個(gè)差異增加蛋白(Fig. 3ab)。鐵蛋白輕鏈和重鏈(FTL和FTH)是鐵在FedEVs中的儲(chǔ)存鐵的蛋白質(zhì)。值得注意的是，只有鐵或鐵和青石棉處理組的FedEVs含有大量的FtL和FtH (Fig. 3cd)，這與鐵過量有關(guān)。作者還證實(shí)了在體內(nèi)，F(xiàn)tL和CD63在青石棉肉芽腫周圍的間皮細(xì)胞上的共定位(Fig. 3e)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)edEVs可以通過鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。
圖3非選擇性蛋白質(zhì)組分析顯示鐵蛋白是石棉誘導(dǎo)的FedEVs的主要成分
為了進(jìn)一步了解FedEVs的生物學(xué)意義，對(duì)FedEVs受體間皮細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序和轉(zhuǎn)錄分析。該分析在FedEVs暴露后的FedEVs-high或-low間皮細(xì)胞上進(jìn)行了3個(gè)重復(fù)，該細(xì)胞通過鐵死亡的巨噬細(xì)胞來源的GFP-CD63分化，以未處理的間皮細(xì)胞為對(duì)照(Fig. 4a)。FDR校正的p值小于0.01和log2FC絕對(duì)值大于0.5為參數(shù)，鑒定出245個(gè)差異表達(dá)基因，其中163個(gè)表達(dá)上調(diào)，82個(gè)表達(dá)下調(diào)(Fig. 4bc)。GO分析將FedEVs受體細(xì)胞的基因表達(dá)變化與有絲分裂期的細(xì)胞周期聯(lián)系起來，而中體和著絲粒在細(xì)胞成分中占過多的比例(Fig. 4d)。上調(diào)基因的基因集富集分析(GSEA)也顯示在FedEVs-high受體間皮細(xì)胞中有絲分裂相關(guān)基因集顯著上調(diào)(Fig. 4e)。特別是，在FedEVs-high的受體間皮細(xì)胞中，Cyclin B1和Cyclin D1的表達(dá)增加(Fig. 4fg)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)edEVs的攝取和有絲分裂過程在受體間皮細(xì)胞中是一致的。
圖4間皮細(xì)胞中FedEVs攝取與有絲分裂的一致性
5、有絲分裂間皮細(xì)胞內(nèi)化FedEVs導(dǎo)致鐵超載
為了確定有絲分裂間皮細(xì)胞是否確實(shí)內(nèi)化了FedEVs，建立了FedEVs供體BFP-CD63巨噬細(xì)胞(THP1)和表達(dá)Fucci的受體間皮細(xì)胞，其中G1(紅色)、S(黃色)和G2/M(綠色)相位顯示不同的熒光(fMeT- 5A)。結(jié)合FACS和免疫印跡分析可以同時(shí)檢測(cè)具有BFP-CD63的FedEVs-high受體細(xì)胞(Fig. 5a)和間皮細(xì)胞的G1、S和G2/M期(Fig. 5be)。攝取FedEVs后，在S期和G2/M期fMeT-5A細(xì)胞中BFP-CD63增加(Fig. 5c-e)。此外，與未處理細(xì)胞相比，F(xiàn)edEVs受體間皮細(xì)胞中FtL和FtH蛋白水平升高，而TfR1和IRP2表達(dá)下降，表明處于鐵充足狀態(tài)（Fig. 4fg）。相反，鐵相關(guān)蛋白的表達(dá)在FedEVs受體間皮細(xì)胞的G1期和G2/M期之間沒有明顯變化（Fig. 5fg）。此外，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，包括細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1，和CDKs，在未處理對(duì)照組和FedEVs受體間皮細(xì)胞之間也沒有表達(dá)變化（Fig. 5fg）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)edEVs的攝入直接導(dǎo)致鐵過剩，而沒有明顯改變細(xì)胞周期。
圖5有絲分裂間皮細(xì)胞特異性內(nèi)吞FedEVs。
6、內(nèi)吞FedEVs增強(qiáng)間皮細(xì)胞DNA損傷
為了評(píng)估FedEVs受體間皮細(xì)胞中的DNA損傷，進(jìn)行了氧化DNA堿基修飾和DNA雙鏈斷裂的FACS和成像分析。8-OHdG是由羥基自由基、單氧或過氧亞硝酸鹽引起的最豐富的DNA修飾之一。γH2AX被快速招募到DNA雙鏈斷裂處進(jìn)行修復(fù)，從而作為DNA損傷標(biāo)志物。間皮細(xì)胞被暴露在石棉誘導(dǎo)的TPH1來源的FedEVs中，24小時(shí)后進(jìn)行γH2AX評(píng)估。結(jié)果觀察到FedEVs的受體細(xì)胞核中8-OHdG和γH2AX水平均顯著增加（Fig. 6a–e），該結(jié)果在腹膜注射的小鼠模型中得到證實(shí)，肉芽腫周圍間皮細(xì)胞中γH2AX，CD63和FtL增加（Fig. 6fg）。
圖6內(nèi)吞FedEVs導(dǎo)致受體間皮細(xì)胞的氧化DNA堿基修飾和DNA雙鏈斷裂
參考文獻(xiàn)：
Ito Fumiya., Kato Katsuhiro., Yanatori Izumi., Murohara Toyoaki., Toyokuni Shinya.(2021). Ferroptosis-dependent extracellular vesicles from macrophage contribute to asbestos-induced mesothelial carcinogenesis through loading ferritin. Redox Biol, 47(undefined), 102174. doi:10.1016/j.redox.2021.102174