自然殺傷細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-1249-3p可減輕2型糖尿病小鼠模型的胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)

2型糖尿病(T2D)是最常見的代謝性糖尿病，其特征是高血糖(也稱為高血糖)及胰島素抵抗。自然殺傷細(xì)胞(NK)被認(rèn)為能通過(guò)調(diào)節(jié)全身炎癥進(jìn)而影響T2D。然而，NK細(xì)胞調(diào)節(jié)胰島素敏感性的機(jī)制尚不清楚，本研究探討NK調(diào)控T2D的分子機(jī)制。本文于2021年10月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF= 12.818。

本文技術(shù)路線：

1、來(lái)自瘦小鼠的自然殺傷（NK）來(lái)源的外泌體可減輕肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗

為探討NK來(lái)源外泌體在胰島素抵抗中的作用，采用高脂飼料(HFD)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立T2D小鼠模型，對(duì)照組飼喂正常鼠糧(NCD)。HFD小鼠體重顯著增加，空腹血糖(Fig 1a)、OGTT(Fig 1b)、ITT(Fig 1c)， HOMA-IR指數(shù)(Fig 1d)結(jié)果顯示， HFD小鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從脾淋巴細(xì)胞中分離NK細(xì)胞，并用超離心法從NK細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離純化外泌體。電子顯微鏡(Fig 1e)和NanoSight分析(Fig 1f)顯示，從條件培養(yǎng)基中分離的NK細(xì)胞顆粒含有豐富的外泌體，其直徑為30 – 150nm。此外，作者從中檢出了HSP70，CD63、TSG101、CD9外泌體標(biāo)志物，此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GRP94的缺失進(jìn)一步證實(shí)分離的顆粒主要是外泌體(Fig 1g)。

為了確定NK來(lái)源外泌體的生物學(xué)功能，NCD小鼠和HFD小鼠分別通過(guò)NCD小鼠NCD來(lái)源性外泌體(NCD- exos)或HFD小鼠NK源性外泌體(HFD- exos)進(jìn)行處理。NCD-Exos將HFD小鼠體重降至正常水平。空腹血糖、OGTT、ITT和HOMA-IR結(jié)果表明，NCD-Exos治療后HFD小鼠全身胰島素敏感性顯著提高(Fig. 1h–k)。然而，在其他組沒(méi)有顯著影響。因此，主要關(guān)注的是NCD-Exos和HFD小鼠的HFD- exos。為了觀察NK來(lái)源地外泌體在體內(nèi)的分布情況，通過(guò)小鼠尾靜脈用紅色熒光PKH26染色的NCD-Exos處理小鼠。結(jié)果表明，NK來(lái)源的外泌體主要集中在內(nèi)臟脂肪組織(VATs)、皮下脂肪組織(sat)、胰島和肝臟，而在肌肉組織(Fig. 1l)。此外，HFD小鼠體內(nèi)肝甘油三酯水平和VAT的重量均顯著增加，但注射了NCD-Exos后，情況就大大緩解了(Fig. 1m, n).。此外，HFD小鼠在內(nèi)臟脂肪組織和肝臟中注射NCD-Exos促炎因子基因表達(dá)明顯下調(diào)。

Fig 1 來(lái)自瘦小鼠的自然殺傷（NK）來(lái)源的外泌體可減輕肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗

2. 脂肪少的NK來(lái)源的外泌體增強(qiáng)細(xì)胞胰島素敏感性

在NCD-Exos處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中，p-Akt和PPARγ的表達(dá)增加，3T3-L1脂肪細(xì)胞中GLUT4表達(dá)也上調(diào)，然而，通過(guò)HFD-Exos處理則無(wú)明顯影響(Fig 2c-i)。

此外，NCD-Exos處理后，3 t3-l1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α顯著下調(diào) (Fig2j, k)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)表明，NCD-Exos可提高脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞的胰島素敏感性，減輕炎癥反應(yīng)，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Fig 2脂肪少的NK來(lái)源的外泌體增強(qiáng)細(xì)胞胰島素敏感性

3. NK來(lái)源的外泌體miR-1249-3p介導(dǎo)細(xì)胞胰島素敏感性和炎癥

越來(lái)越多的證據(jù)表明，大量的miRNAs被封裝在外泌體中，并在細(xì)胞-細(xì)胞通信中發(fā)揮重要作用。因此，作者假設(shè)NK來(lái)源的外泌體miRNA參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞的胰島素敏感性。為了識(shí)別所涉及的特定miRNA，作者首先進(jìn)行了微陣列生成NCD-Exos和HFD-Exos的miRNA表達(dá)譜(Fig 3A)。通過(guò)單通道芯片計(jì)算差異表達(dá)miRNA的比較，發(fā)現(xiàn)1249-3p在NCD-Exos中增加最顯著（Fig 3B)）。GO和KEGG分析顯示miR-1249-3p直接參與代謝通路。此外，miR-1249-3p表達(dá)水平在NCD小鼠肝和肝中顯著升高。

接下來(lái)，為了驗(yàn)證了外泌體miRNAs是否由NK細(xì)胞分泌并運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞。轉(zhuǎn)染熒光cy3標(biāo)記的擬態(tài)miR-1249-3p后，NK細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞或AML12細(xì)胞在Transwell TM平板中進(jìn)行共培養(yǎng)(Fig 3c)。 Cy3染料在3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中的出現(xiàn)，表明擬態(tài)Cy3- mir -1249-3p能從Transwell TM上部的NK細(xì)胞傳遞到下部的受體脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞。Cy3染料伴在3T3-L1脂肪細(xì)胞以及AML12細(xì)胞中隨著miR-1249-3p豐度的增加而增加 (Fig 3c)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，作者單獨(dú)使用Cy3染色(未與miR-1249-3p結(jié)合)處理NK細(xì)胞，再與3T3-L1脂肪細(xì)胞與AML12細(xì)胞共培養(yǎng)后并沒(méi)有檢測(cè)到Cy3染色。此外，NCD小鼠外泌體中miR-1249-3p的表達(dá)明顯高于NFD小鼠，這可能是由于外泌體通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)從脾NK細(xì)胞遷移到靶細(xì)胞 (Fig  3b)?？傊饷隗wmiR-1249-3p可由NK細(xì)胞分泌，并被脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞攝取。

此外，還檢測(cè)了miR-1249-3p對(duì)胰島素功能的影響。將擬態(tài)MiR-1249-3p、抑制劑和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MiR-1249-3p顯著增加了3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素刺激下的葡萄糖攝取(Fig 3d)，同時(shí)伴有促炎癥因子表達(dá)下調(diào)(Fig 3e)。在AML12細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染擬態(tài)MiR-1249-3p促進(jìn)胰島素對(duì)葡萄糖產(chǎn)生抑制作用(Fig 3f)，同時(shí)促炎因子表達(dá)降低(Fig3g)。綜上所述，上述結(jié)果提示NCD小鼠NK來(lái)源的外泌體miR-1249-3p可促進(jìn)細(xì)胞胰島素敏感性，減輕炎癥反應(yīng)。

Fig 3 NK來(lái)源的外泌體miR-1249-3p介導(dǎo)細(xì)胞胰島素敏感性和炎癥

4. 外泌體miR-1249-3p直接靶向SKOR1介導(dǎo)胰島素敏感性

為了確定外泌體miR-1249-3p的靶點(diǎn)，作者先使用了兩種生物信息學(xué)工具(miRDB和TargetScan)來(lái)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一組共同的靶點(diǎn)基因，并證實(shí)SKI家族轉(zhuǎn)錄共抑制因子1 (SKOR1)是miR-1249 - 3 - p的直接靶點(diǎn) (Fig 4a)。在3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中，SKOR1蛋白表達(dá)被miR-1249-3p下調(diào) (Fig 4b)。然而，SKOR1 mRNA水平基本沒(méi)有變化。隨后，miR-1249-3p與SKOR1全長(zhǎng)之間的序列比對(duì)顯示SKOR1的3'UTR可能是miR-1249-3p的潛在靶點(diǎn)(Fig  4c)。然后將野生型和突變的miR- 1249-3p結(jié)合位點(diǎn)克隆到熒光素酶載體中。發(fā)現(xiàn)與野生型結(jié)合位點(diǎn)載體共轉(zhuǎn)染miR-1249-3p的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低。然而，含有突變結(jié)合位點(diǎn)載體的細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出這種抑制(Fig 4d)。 此外， 在HFD小鼠的內(nèi)臟脂肪組織和肝臟中，NCD-Exos能降低了SKOR1蛋白的表達(dá)(Fig. 4e)。這些結(jié)果表明SKOR1是脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中miR-1249-3p的直接靶點(diǎn)。

此外，作者發(fā)現(xiàn)，敲低SKOR1增加了3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取，并促進(jìn)了胰島素對(duì)AML12細(xì)胞中葡萄糖產(chǎn)生的抑制作用，同時(shí)兩個(gè)細(xì)胞中的促炎因子減少(Fig 4f-i)，這被miR-1249- 3 p抑制劑中和(Fig. 4j–q)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SKOR1是miR-1249-3p的直接下游靶點(diǎn)，并介導(dǎo)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

Fig4外泌體miR-1249-3p直接靶向SKOR1介導(dǎo)胰島素敏感性

5. SKOR1在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中與SMAD6相互作用

作者通過(guò)蛋白互作預(yù)測(cè)工具評(píng)估SKOR1與蛋白的相互作用，并找到了LBX1和SMAD 6 (Fig 5a)。進(jìn)一步探索SKOR1和SMAD6之間的關(guān)系。由于SKOR1沒(méi)有改變 3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中SMAD6的表達(dá)(Fig. 5b–d), 于是假設(shè)SKOR1可能通過(guò)TLR4/NF-κB通路與SMAD6相互作用調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。通過(guò)免疫沉淀反應(yīng)發(fā)現(xiàn)SKOR1-IP細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到SMAD6 (Fig. 5e)。然后，SMAD6-IP抗體細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到檢測(cè)SKOR1SMAD6-IP片段(Fig5e)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明SKOR1在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中與SMAD6相互作用。

Fig 5 SKOR1在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中與SMAD6相互作用

6. MiR-1249-3p通過(guò)SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗

以上結(jié)果表明，miR-1249-3p抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的表達(dá)，SKOR1是miR-1249-3p的直接靶點(diǎn)，SKOR1與SMAD6相互作用。之前的研究已經(jīng)闡明SMAD6與SMURF1結(jié)合以及MyD88形成SMAD6/ MyD88/SMURF1三元復(fù)合物，進(jìn)而抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的證據(jù)；TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合，進(jìn)一步激活NF-κB，從而促進(jìn)a中多種炎癥因子的上調(diào)。因此，作者猜想miR-1249-3p/SKOR1軸在TLR4/NF-κ b依賴的促炎信號(hào)通路中起重要作用。

首先，作者轉(zhuǎn)染了擬態(tài)miR-1249-3p或siRNA -SKOR1到 3T3-L1脂肪細(xì)胞和AML12細(xì)胞中(Fig 6a, b)。免疫印跡分析及ELISA分析(Fig 6d-f)顯示轉(zhuǎn)染擬態(tài)miR-1249-3p或敲低SKOR1顯著抑制p65磷酸化，進(jìn)而下調(diào)促炎基因IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明，miR-1249-3p/SKOR1軸通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路抑制促炎基因表達(dá)。SMAD6沉默時(shí)，miR-1249-3p對(duì)TLR4/NF-κB軸活化的抑制作用得到緩解，但未完全阻斷(Fig. 6c, g, h)，提示SMAD6在miR-1249-3p介導(dǎo)的胰島素抵抗和炎癥減弱中起重要作用，在此過(guò)程中可能存在其他信號(hào)通路?？傊@些結(jié)果表明，NK來(lái)源的外泌體miR-1249-3p通過(guò)SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸緩解胰島素抵抗和炎癥(Fig 6i)。

Fig 6 MiR-1249-3p通過(guò)SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗

   綜上所述，本研究揭示了nk來(lái)源的外泌體miR-1249-3p通SKOR1-SMAD6-TLR4-NF-κB軸減輕胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，并在T2D中提供一系列潛在的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究miR-1249-3p和SKOR1阻滯劑在T2D小鼠中的治療效果和臨床試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

Wang, Y., et al., Natural killer cell-derived exosomal miR-1249-3p attenuates insulin resistance and inflammation in mouse models of type 2 diabetes. Signal Transduct Target Ther, 2021. 6(1): p. 409.