KIAA1429-結(jié)直腸癌預(yù)后標(biāo)志物

m6A是哺乳動(dòng)物中最豐富的mRNA修飾，參與了mRNA的代謝。KIAA1429被認(rèn)為是最大的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，在m6A修飾中發(fā)揮重要作用。然而，KIAA1429在結(jié)直腸癌(CRC)中的預(yù)后價(jià)值和功能尚不清楚。我們研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429在結(jié)直腸癌組織中顯著上調(diào)。KIAA1429高表達(dá)患者的總生存期較低表達(dá)患者短。KIAA1429在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。KIAA1429通過與WEE1 mRNA 3′-UTR第三段結(jié)合，以m6A獨(dú)立的方式降低WEE1的穩(wěn)定性，從而對(duì)WEE1的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。此外，丁酸通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NFκB1的水平降低了KIAA1429的表達(dá)。這些結(jié)果提示KIAA1429可能是CRC潛在的預(yù)后指標(biāo)。本文于2021年11月發(fā)表在“Oncogene”（IF: 9.867）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）KIAA1429在人CRC中表達(dá)上調(diào)

我們對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與相鄰正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中KIAA1429的mRNA表達(dá)升高(圖1A)。此外，KIAA1429的高表達(dá)與臨床分期進(jìn)展相關(guān)(圖1B)。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析，ROC曲線下面積(AUC)為0.70(圖1C)。ROC分析結(jié)果提示KIAA1429可能是CRC的診斷標(biāo)志物。Kaplan Meier生存分析表明，KIAA1429表達(dá)高的CRC患者的OS比KIAA1429表達(dá)低的CRC患者的OS短(圖1D)。為了證實(shí)TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)集中分析的結(jié)果，我們通過qRT PCR檢測(cè)了43對(duì)結(jié)直腸癌組織和鄰近正常組織中KIAA1429的表達(dá)，并通過IHC檢測(cè)了5對(duì)結(jié)直腸癌組織和鄰近正常組織中KIAA1429的表達(dá)。結(jié)果表明，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，與相鄰正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中KIAA1429的表達(dá)顯著增加（圖1E、G）。通過43對(duì)CRC組織和相鄰正常組織分析，AUC為0.66(圖1F)，這驗(yàn)證了KIAA1429可能是CRC的診斷生物標(biāo)志物。Kaplan–Meier生存分析表明KIAA1429高表達(dá)的結(jié)腸癌患者OS和無進(jìn)展生存率（PFS）較差（圖1H，I）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明KIAA1429在結(jié)腸癌組織中升高，可能是結(jié)腸癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。

2）KIAA1429在體內(nèi)外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

CCK-8和集落形成分析表明KIAA1429的下調(diào)抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力（圖2A，C），而KIAA1429的過表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力（圖2B，D）。細(xì)胞周期分析表明，KIAA1429的敲除增加了G2期細(xì)胞的百分比（圖2E），KIAA1429的過表達(dá)降低了G2期細(xì)胞的百分比（圖2F）。此外，沉默KIAA1429表達(dá)顯著抑制體內(nèi)CRC腫瘤生長和腫瘤重量（圖2G-I）。綜上所述，這些結(jié)果表明KIAA1429可能作為癌基因在體外和體內(nèi)促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖。

3）KIAA1429負(fù)調(diào)控WEE1表達(dá)

為了進(jìn)一步探索KIAA1429促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們?cè)贙IAA1429敲除細(xì)胞和相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行RNA-seq檢測(cè)（圖3A）。在我們之前的研究中，進(jìn)行了RNA免疫沉淀和mRNA高通量測(cè)序（RIP-seq），以確定與KIAA1429蛋白相關(guān)的mRNA。在本研究中，我們通過結(jié)合RNA-seq和RIP-seq鑒定的差異表達(dá)基因進(jìn)行Venn分析，結(jié)果顯示63個(gè)基因重疊（圖3B）。KEGG途徑分析表明，細(xì)胞周期途徑是最豐富的途徑，主要包括WEE1、染色體1A的結(jié)構(gòu)維持、轉(zhuǎn)錄因子Dp-1和小染色體維持復(fù)合物成分3。通過qRT PCR分析驗(yàn)證這些基因，結(jié)果顯示W(wǎng)EE1在四個(gè)基因中變化最顯著（圖3C-F）。因此，WEE1被選為KIAA1429的候選下游目標(biāo)，以供進(jìn)一步研究。WEE1蛋白水平在KIAA1429敲除細(xì)胞中升高，在KIAA1429過表達(dá)細(xì)胞中降低（圖3G，H）。根據(jù)IHC分析（圖3I），在KIAA1429基因敲除的異種移植組織中，WEE1表達(dá)上調(diào)。此外，結(jié)腸癌組織中WEE1的mRNA水平降低（圖3J），并且與結(jié)腸癌組織中KIAA1429的mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（圖3K）。這些結(jié)果表明KIAA1429對(duì)WEE1的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

4）KIAA1429通過WEE1介導(dǎo)的腫瘤增殖調(diào)控促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生

qRT-PCR和western blot檢測(cè)證實(shí)沉默KIAA1429調(diào)控的增加的WEE1在WEEI敲除的DLD-1和LoVo細(xì)胞中表達(dá)明顯降低（圖4A，B）。WEE1的沉默逆轉(zhuǎn)了DLD-1和LoVo細(xì)胞中KIAA1429基因敲除抑制的細(xì)胞增殖和集落形成能力（圖4C-E）。細(xì)胞周期分析表明，敲除KIAA1429可增加G2期細(xì)胞的百分比，通過沉默WEE1可降低G2期細(xì)胞的百分比（圖4F）。與這些觀察結(jié)果一致，KIAA1429的敲除抑制了體內(nèi)CRC腫瘤的生長，WEE1下調(diào)逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（圖4G-I）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明KIAA1429通過調(diào)節(jié)結(jié)腸癌中WEE1的表達(dá)在促進(jìn)腫瘤增殖中起著關(guān)鍵作用。

5）KIAA1429以非m6A依賴的方式調(diào)節(jié)WEE1的mRNA表達(dá)

RIP分析證實(shí)，在KIAA1429組中WEE1 mRNA顯著富集，但在IgG組中未富集（圖5A）。此外，在用Act D處理的DLD-1和LoVo細(xì)胞中敲除KIAA1429后，WEE1轉(zhuǎn)錄本的半衰期增加（圖5B）。這些結(jié)果表明KIAA1429與WEE1 mRNA結(jié)合，并以轉(zhuǎn)錄后方式降低WEE1 mRNA的穩(wěn)定性。接著，我們檢測(cè)其是否以m6A依賴的方式調(diào)控WEE1的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，敲除KIAA1429不會(huì)改變m6A修飾的WEE1 mRNA水平（圖5C）。然而，METTL3基因敲除降低了WEE1 mRNA的m6A修飾水平（圖5D）。此外，METTL3敲除后，與KIAA1429相互作用的WEE1 mRNA的數(shù)量沒有明顯差異（圖5E）。這些結(jié)果表明KIAA1429不影響WEE1 mRNA的m6A水平，并且KIAA1429和WEE1之間的相互作用不受m6A修飾的影響。接下來，我們探討KIAA1429是否以m6A非依賴性方式降低WEE1 mRNA的穩(wěn)定性。RIP序列結(jié)果顯示KIAA1429與WEE1 mRNA的結(jié)合位點(diǎn)位于3′-UTR。為了進(jìn)一步確定KIAA1429和WEE1 mRNA之間的結(jié)合位點(diǎn)，我們將WEE1 mRNA的預(yù)測(cè)3′-UTR分為三個(gè)片段。WEE1 mRNA中3′-UTR的第三段被抗KIAA1429抗體顯著富集，但其他兩段未被該抗體富集（圖5F）。因此，我們對(duì)WEE1 mRNA的3′-UTR的第三段進(jìn)行突變，以供進(jìn)一步研究（圖5G）。KIAA1429沉默后熒光素酶活性增加，經(jīng)WEE1-3’-UTR MT3挽救（圖5H）。綜上所述，這些結(jié)果表明KIAA1429通過以m6A非依賴性方式降低WEE1 mRNA的穩(wěn)定性來下調(diào)WEE1的表達(dá)。

6）丁酸通過轉(zhuǎn)錄因子NFκB1抑制KIAA1429的表達(dá)

我們之前的研究報(bào)告，丁酸鹽是腸道菌群的代謝物，通過下調(diào)METTL3的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。因此，我們探討了KIAA1429的表達(dá)是否也受丁酸的調(diào)控。如圖6A所示，丁酸處理后KIAA1429的表達(dá)顯著降低。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFκB1可能與KIAA1429基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。因此，我們推測(cè)丁酸可能通過降低NFκB1的表達(dá)來下調(diào)KIAA1429的表達(dá)。丁酸處理后，NFκB1和p-IKBα的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低（圖6B，C）。此外，沉默NFκB1降低了KIAA1429的mRNA和蛋白質(zhì)水平（圖6D-F）。在敲低NFκB1后，熒光素酶活性降低，這通過KIAA1429啟動(dòng)子區(qū)域的突變得以挽救（圖6G）。

  結(jié)論：我們首次報(bào)道KIAA1429是CRC中一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志物，它通過m6A獨(dú)立方式下調(diào)WEE1表達(dá)促進(jìn)增殖。此外，KIAA1429在CRC組織中表達(dá)明顯升高，與CRC患者生存率低相關(guān)。丁酸通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NFκB1降低KIAA1429的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)可能為前瞻性的多機(jī)構(gòu)試驗(yàn)鋪平道路，以測(cè)試KIAA1429作為CRC患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：Ma L, Lin Y, Sun SW, Xu J, Yu T, Chen WL, Zhang LH, Guo YC, Wang YW, Chen T, Wei JF, Zhu LJ. KIAA1429 is a potential prognostic marker in colorectal cancer by promoting the proliferation via downregulating WEE1 expression in an m6A-independent manner. Oncogene. 2021 Nov 24. doi: 10.1038/s41388-021-02066-z. Epub ahead of print. PMID: 34819634.