血管生成素通過精子tsRNA介導(dǎo)父系炎癥引起的子代代謝紊亂

父系環(huán)境輸入可影響后代的各種表型，對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)、公共衛(wèi)生和政策產(chǎn)生重大影響。然而，什么樣的信號(hào)作為連接父系環(huán)境信息傳遞給后代的紐帶仍不清楚。本研究展示了有炎癥的父親的后代表現(xiàn)出包括葡萄糖耐受不良和肥胖在內(nèi)的代謝紊亂。并發(fā)現(xiàn)血管生成素（Ang）介導(dǎo)的5 - tsRNA在精子中的生物發(fā)生有助于父親炎癥誘導(dǎo)的后代代謝紊亂。本研究于2021年11月發(fā)表在《Nature Communications》IF：14.919期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、父系炎癥誘導(dǎo)子代代謝紊亂

雄性小鼠采用LPS (Inf)或生理鹽水(Con)每隔1天注射4次，連續(xù)7天建立炎癥模型。然后這些老鼠被允許與正常的雌性交配兩天。雄性Inf F1小鼠的雄性后代體重略高于Con F1小鼠，但從8周齡開始，顯著高于Con F1小鼠(Fig. 1a, b)。在13周齡時(shí)，雄性Inf F1小鼠糖耐量受損，在糖耐量試驗(yàn)(GTT)中血糖水平明顯高于Con F1小鼠(Fig. 1c)。但是，胰島素耐受性試驗(yàn)(ITT)和丙酮酸耐受性試驗(yàn)(PTT)結(jié)果無顯著差異(Fig. 1d, e)。值得注意的是，雄性Inf F1小鼠的脂肪-肌肉比例顯著升高(Fig.1f)，同時(shí)脂肪細(xì)胞的平均橫斷面面積增加16% ( Fig. 1g, h)。在Inf F1和Con F1雄鼠之間腓骨肌的質(zhì)量沒有顯著差異，但在跑步機(jī)試驗(yàn)中，通過測(cè)量最大跑步速度，Inf F1雄鼠表現(xiàn)出較低的運(yùn)動(dòng)能力( Fig. 1i)。這些結(jié)果表明，炎癥父親的后代發(fā)展為肥胖和代謝綜合征樣表型。

骨骼肌是葡萄糖攝取的主要部位，參與調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。為了研究骨骼肌中葡萄糖攝取的改變是否導(dǎo)致Inf F1小鼠的葡萄糖耐受不良，我們采集腓腸肌，測(cè)量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLUT4)的表達(dá)和分布，而GLUT4是肌肉組織中葡萄糖攝取的關(guān)鍵。骨骼肌的葡萄糖攝取主要依賴于GLUT4從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存庫到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。免疫組化分析表明，在雄性Con F1小鼠的肌細(xì)胞膜上表達(dá)GLUT4(Fig. 1j)。相反，雄性Inf F1小鼠肌肉表面膜中GLUT4含量明顯降低，細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)GLUT4陽性小泡(Fig. 1k)。為了全面了解轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對(duì)從Inf F1或Con F1小鼠肌肉樣本進(jìn)行RNA-seq。結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在代謝通路(包括2型糖尿病、胰島素信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路)中(Fig. 1l)。

圖1：父系炎癥F1雄鼠體重及代謝指標(biāo)

2、Ang對(duì)于父親炎癥引起的后代代謝紊亂至關(guān)重要

接下來，研究Ang在睪丸、附睪頭和精子發(fā)育成熟的附睪尾的表達(dá)水平。LPS處理24 h后，Ang在附睪頭表達(dá)上調(diào)，睪丸和附睪尾表達(dá)不上調(diào)(Fig. 2a)。在附睪頭中，Ang蛋白水平也有上調(diào)(Fig. 2b)。為了研究Ang在父系炎癥性代謝紊亂中的潛在作用，我們采用Ang+/+ Con、Ang+/+ Inf、Ang-/-Con和Ang-/-Inf模型，將這些小鼠與正常雌性小鼠交配，然后檢測(cè)其后代的代謝參數(shù)(Fig. 2c)。Ang+/+ Inf雄性小鼠體重略有增加，但和Ang+/+ Con比顯著增加(Fig. 2d)。此外，Ang+/+ Inf雄性小鼠脂肪-肌肉比例顯著升高(Fig.2e)，F(xiàn)1雄性小鼠葡萄糖顯著增加(Fig.2f ,g)。但是Ang-/-Inf雄性小鼠沒有表達(dá)除葡萄糖耐受性差異(Fig.2f,g)。腓腸肌質(zhì)量沒有顯著差異(補(bǔ)充圖3f)，但在跑步試驗(yàn)中，Ang+/+ Inf F1小鼠顯示出較低的跑步機(jī)跑步能力(Fig.2h)。然而，Ang-/-Inf雄性小鼠沒有表現(xiàn)出任何明顯的代謝異?；蜻\(yùn)動(dòng)功能受損(Fig.2e-h)。以上結(jié)果表明Ang對(duì)于父親炎癥引起的后代代謝紊亂至關(guān)重要。

圖2：Ang在炎癥小鼠中的表達(dá)及炎癥小鼠和Ang缺失小鼠F1雄鼠的代謝參數(shù)

3、炎癥和Ang突變改變精子尾部tsRNA的表達(dá)

為了確定炎癥和Ang缺失是否會(huì)影響精子中的tsRNA組成，對(duì)從Ang+/+ Con、Ang+/+ Inf、Ang-/-Con和Ang-/-Inf小鼠中分離的精子尾端進(jìn)行了小RNA深度測(cè)序。根據(jù)其起源的tRNAs的區(qū)域，tsRNAs可分為4類:5’ -tsRNAs、3’ -tsRNAs、CCAtsRNAs和其他tsRNAs。4種tsRNA中，5’- tsRNA在附睪尾精子中含量最多(72.4% ~ 80.2%)，3’- tsRNA、CCA - tsRNA和其他tsRNA的含量較小(Fig. 3a–h)。有趣的是，炎癥和Ang缺失都會(huì)影響個(gè)體精子的5’ –tsRNAs的表達(dá)。炎癥誘導(dǎo)5’ –tsRNAs組分微量增加，Ang缺失能導(dǎo)致5’ –tsRNAs組織明顯減少(Fig. 3a–h)。由于30-35nt的5’- tsRNA在成熟小鼠精子中極為豐富，作者對(duì)這些RNA進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)分析。在30-35 nt的5’- tsRNA中，與Ang+/+ Con小鼠相比，Ang+/+ Inf小鼠中88個(gè)5’-tsRNA表達(dá)水平升高，17個(gè)基因表達(dá)水平降低(Fig. 3i)。Ang的缺失幾乎完全否定了炎癥對(duì)精子5’- tsRNA的影響，包括來自細(xì)胞核和線粒體編碼的tRNAs (Fig. 3i-m)。炎癥誘導(dǎo)的tsRNA的突出例子包括5’- tsRNA-Gly-GCC、5’-tsRNA-iMET-CAT和5’-MT-tsRNA-VAL-TAC，它們的豐度顯示增加了2 - 3倍，而Ang缺失后又降低到基線水平(Fig. 3j-m)。令人驚訝的是，一些5’- tsRNA，如5’-tsRNA-Cys-GCA，在炎癥小鼠中上調(diào)，但Ang缺失并沒有逆轉(zhuǎn)其表達(dá)水平(Fig. 3n)。Northern blot分析也證實(shí)了5’- tsRNA-Gly-GCC水平的變化(Fig.3o)。這些數(shù)據(jù)表明，炎癥誘導(dǎo)的精子tsRNA組成發(fā)生顯著變化，Ang缺失可以阻斷炎癥對(duì)精子5’-tsRNA譜的影響。

圖3：炎癥和Ang缺失小鼠的精子tsRNA表達(dá)

4、Ang缺失炎癥男性的精子tsRNA很少引起后代的代謝紊亂

為了評(píng)估精子tsRNA是否能將父親的信息傳遞給后代，作者使用Ang+/+ Con、Ang+/+ Inf、Ang-/-Con和Ang-/-Inf小鼠模型，進(jìn)行合子精子RNA注射方案(Fig. 4a)。收集Ang+/+ Con、Ang+/+ Inf、Ang-/-Con和Ang-/-Inf雄性精子的30-40nt RNA片段，并進(jìn)行合子注射，以水注射為對(duì)照。Ang+/+ Inf組的F1雄性后代糖耐量受損，GTT檢測(cè)結(jié)果表明，與Ang+/+ Con和Ang-/-Con雄性后代以及對(duì)照組相比，葡萄糖水平明顯升高(Fig. 4b-c)。相反，Ang-/-Inf組的F1雄鼠未表現(xiàn)出相對(duì)于Ang+/+ Inf組的代謝紊亂，而表現(xiàn)出與Ang+/+ Con和Ang-/-Con雄鼠及對(duì)照組相似的代謝紊亂模式(Fig. 4b-c)。Ang+/+ Inf F1雄鼠的體重微弱增加，但較Ang-/-Con組和對(duì)照組的F1小鼠顯著增加(Fig. 4d)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，與Ang+/+ Con、Ang-/-Inf和Ang-/-Con雄性后代以及對(duì)照組相比，Ang+/+ Inf子代也顯示出更高的脂肪-肌肉質(zhì)量比(Fig. 4e)。總之，合子注射30-40nt RNA片段的結(jié)果強(qiáng)烈表明，炎癥雄性鼠中Ang缺失會(huì)破壞精子RNA誘導(dǎo)后代代謝表型的能力。

接下來，作者合成了表達(dá)最高的5’- tsRNA組合，其豐度在炎癥小鼠精子中顯示增加，而在精子中通過Ang缺失降低到基線水平（Fig. 3j）以研究它們是否能模擬內(nèi)源性精子tsRNA的功能。精子RNA組F1雄性后代糖耐量受損，GTT檢測(cè)結(jié)果表明，與重組RNA組、合成tsRNAs組及對(duì)照組相比，其葡萄糖水平明顯升高(Fig. 4f, g)。引人注目的是，合成tsRNAs組的F1雄鼠與重組RNA組相比，葡萄糖水平有輕微但顯著的增加(Fig. 4f, g)。此外，與重組RNA、精子RNA和對(duì)照組相比，合成的tsRNAs注射組的子代表現(xiàn)出更高的體重(Fig. 4h)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，合成tsRNAs和精子RNAs組的小鼠顯示出脂肪-肌肉比率升高(Fig. 4i)。總之，結(jié)果表明，合子注射一組合成的tsRNA可以部分誘導(dǎo)后代的代謝表型。

圖4：精子合子注射30 ~ 40 nt RNA或合成tsRNA產(chǎn)生的F1雄性的體重和代謝參數(shù)

參考文獻(xiàn)：

Zhang Yanwen., Ren Li., Sun Xiaoxiao., Zhang Zhilong., Liu Jie., Xin Yining., Yu Jianmin., Jia Yimin., Sheng Jinghao., Hu Guo-Fu., Zhao Ruqian., He Bin.(2021). Angiogenin mediates paternal inflammation-induced metabolic disorders in offspring through sperm tsRNAs. Nat Commun, 12(1), 6673. doi:10.1038/s41467-021-26909-1