環(huán)狀RNA ACTN4促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌的進(jìn)展

肝內(nèi)膽管癌(ICC)是一種原發(fā)性肝癌，侵襲性高，預(yù)后極差。circRNAs在ICC癌變發(fā)生和進(jìn)展中的作用仍有待確定。我們研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自ACTN4基因外顯子1-外顯子20的Hsa_circ_0050898(命名circACTN4)在ICC中顯著上調(diào)。circACTN4的高表達(dá)與體外和體內(nèi)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)以及ICC切除術(shù)后較差的預(yù)后相關(guān)。此外，circACTN4通過(guò)海綿蛋白miR-424-5p上調(diào)YAP1的表達(dá)。更重要的是，circACTN4還招募YBX1刺激FZD7轉(zhuǎn)錄。circACTN4在ICC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了YAP1和β-catenin之間的相互作用。這些結(jié)果表明circACTN4是ICC潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2021年9月發(fā)表在“Journal of Hepatology”（IF: 25.083）期刊上。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果

1）CircACTN4在ICC組織中上調(diào)

芯片分析顯示與鄰近的非腫瘤組織比較，以log2 fold change >4.0 和p <0.05 為前提，17個(gè)circRNA在ICC組織中顯著上調(diào)(圖1A,B)。在 4個(gè)高表達(dá)的circRNA中，circACTN4的上調(diào)最顯著。通過(guò)60對(duì)樣品的qRT-PCR，證實(shí)了circACTN4在ICC組織中過(guò)表達(dá)，并對(duì)RNase R處理產(chǎn)生了抵抗(圖1C,D)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中circACTN4的表達(dá)，在RBE和FRH0201細(xì)胞中分別發(fā)現(xiàn)了circACTN4的低表達(dá)和高表達(dá)(圖1E)。使用熒光原位雜交和亞細(xì)胞分離試驗(yàn)，在RBE和FRH0201細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中觀(guān)察到circACTN4轉(zhuǎn)錄本(圖1F,G)。與低circACTN4表達(dá)相比，在ICC中高circACTN4表達(dá)與較差的3年總生存率和更高的復(fù)發(fā)率相關(guān) (圖1H, I)。

2）CircACTN4促進(jìn)體外和體內(nèi)ICC細(xì)胞的增殖和侵襲

在集落形成實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)circACTN4促進(jìn)RBE細(xì)胞的增殖，而敲除circACTN4抑制FRH0201細(xì)胞的增殖(圖2A)。在transwell實(shí)驗(yàn)中，RBE細(xì)胞的遷移和侵襲增強(qiáng)，而FRH0201細(xì)胞的遷移和侵襲被抑制(圖2B)。在內(nèi)皮管形成實(shí)驗(yàn)中，RBE細(xì)胞上清液的促血管刺激因子增加了管長(zhǎng)，而FRH0201細(xì)胞上清則相反(圖2C)。在異種移植模型中，circACTN4沉默組肺轉(zhuǎn)移數(shù)量和腫瘤生長(zhǎng)較低，而circACTN4過(guò)表達(dá)組較高(圖2D-G)。

3）CircACTN4調(diào)控FZD7在ICC細(xì)胞中的表達(dá)

RNA-seq在過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中鑒定出103個(gè)差異表達(dá)基因 (圖3A, B)。KEGG通路分析顯示，Hippo相關(guān)基因(MOB1B、ID2、APC、PPP1CB、CCN2、PRKCI、BMPR2、YAP1和YWHAG)和wnt相關(guān)基因(ROCK2、EP300、APC、FZD7和AXIN2)均富集并過(guò)表達(dá)circACTN4。qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了這些基因在過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(圖3C, D)。Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)ZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也隨著circACTN4的過(guò)表達(dá)或敲除而改變(圖3E)。

FZD7，Wnt/β-catenin通路的受體，在Hippo和Wnt通路中與ICC細(xì)胞中circACTN4過(guò)表達(dá)相關(guān)均升高。RNA-seq結(jié)果顯示，在circACTN4沉默的FRH0201細(xì)胞中，F(xiàn)ZD7的表達(dá)顯著下調(diào)。在RNA-seq的559個(gè)DEGs中，Hippo信號(hào)通路也顯著富集(圖S5C-F)。利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD7在ICC組織中的表達(dá)水平顯著高于非腫瘤組織(圖3F)。這些結(jié)果通過(guò)組織樣本的qRT-PCR和IHC進(jìn)一步證實(shí)(圖3G, H)。此外，在20個(gè)ICC組織中，circACTN4的表達(dá)與FZD7的表達(dá)呈正相關(guān)(圖3I)。為了確定circACTN4是否調(diào)控FZD7的轉(zhuǎn)錄，我們?cè)贔RH0201細(xì)胞中進(jìn)行了ChIRP (RNA提取染色質(zhì))實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示circACTN4在FZD7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的?1200到?800 bp區(qū)域富集(圖3J)。同時(shí)，在FRH0201細(xì)胞中，circACTN4沉默后，H3K27Ac組蛋白活性修飾在同一位點(diǎn)的富集減少，而在RBE細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)circACTN4后，H3K27Ac組蛋白活性修飾增加(圖3K, L)。這些結(jié)果表明，circACTN4可以結(jié)合FZD7啟動(dòng)子并觸發(fā)FZD7的表達(dá)。

4）CircACTN4與YBX1相互作用

RNA下拉和western blotting顯示，生物素標(biāo)記的circACTN4探針可以在FRH0201細(xì)胞裂解液中沉淀內(nèi)源性的YBX1(圖4A)， RIP和RNA EMSA進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4B, C)。這些結(jié)果表明circACTN4和YBX1之間存在相互作用。circACTN4的表達(dá)與YBX1呈正相關(guān)(圖4D)。此外，TCGA數(shù)據(jù)顯示，YBX1在ICC組織中的表達(dá)明顯高于非腫瘤組織(圖4E)，這一點(diǎn)通過(guò)qRT-PCR和IHC在ICC組織樣本、RBE和FRH0201細(xì)胞系中得到了驗(yàn)證(圖4F, G)。circACTN4在RBE細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，在FRH0201細(xì)胞中敲除，均不影響YBX1 mRNA的表達(dá)(圖4G)。這些結(jié)果表明，circACTN4與YBX1相互作用，并在ICC進(jìn)展過(guò)程中啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。

5）CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的轉(zhuǎn)錄

ChIP-seq分析顯示，F(xiàn)RH0201細(xì)胞中YBX1結(jié)合區(qū)域廣泛分布于基因組中，其中24.88%為啟動(dòng)子(圖5A, B)。對(duì)YBX1結(jié)合區(qū)域的Motif分析顯示其結(jié)合序列偏好存在差異(圖5C)。通過(guò)重疊RNA-seq和ChIP-seq的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)FZD7是ICC細(xì)胞中circACTN4和YBX1的靶點(diǎn)(圖5D)。ChIP-qPCR結(jié)果顯示，YBX1在ICC細(xì)胞中參與FZD7表達(dá)的調(diào)控，因?yàn)閅BX1與FZD7啟動(dòng)子在同一位點(diǎn)富集(圖5E)，這與circACTN4的結(jié)果一致(圖3J)。此外，在FRH0201細(xì)胞中，YBX1敲低抑制了H3K27Ac修飾在FZD7啟動(dòng)子上的富集(圖5F)。為了進(jìn)一步證實(shí)circACTN4和YBX1共同調(diào)控FZD7的轉(zhuǎn)錄，我們?cè)贔RH0201細(xì)胞中敲除circACTN4，發(fā)現(xiàn)YBX1在FZD7啟動(dòng)子上的富集減少(圖5G)。FZD7 mRNA和蛋白水平在FRH0201細(xì)胞中的變化也與YBX1過(guò)表達(dá)和敲低一致(圖5H)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，YBX1恢復(fù)挽救了FZD7下調(diào)介導(dǎo)的FRH0201細(xì)胞生長(zhǎng)、血管形成和轉(zhuǎn)移的抑制(圖5I-L)。這些結(jié)果提示circACTN4可能在YBX1介導(dǎo)的FZD7在ICC細(xì)胞中的表達(dá)中起重要作用。

6）CircACTN4通過(guò)海綿吸收miR424-5p上調(diào)YAP1的表達(dá)

circRNA Interactome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circACTN4可作為多個(gè)miRNA的海綿。通過(guò)結(jié)合來(lái)自Starbase和Circbase的miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，12個(gè)候選miRNA被預(yù)測(cè)為circACTN4和YAP1的靶點(diǎn)(圖6A)。使用TCGA，發(fā)現(xiàn)12個(gè)候選基因中有6個(gè)在ICC組織中表達(dá)。此外，在轉(zhuǎn)染si-circACTN4的FRH0201細(xì)胞中，只有miR-424-5p上調(diào)(圖6B)，而在RNA RIP檢測(cè)中，circACTN4可直接與miR-424-5p結(jié)合(圖6C)。轉(zhuǎn)染miR-424-5p的模擬物可降低RBE細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖6 D,E)。此外，在轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimic的RBE細(xì)胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平顯著降低，這與轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor的RBE細(xì)胞中的YAP1 mRNA和蛋白水平形成鮮明對(duì)比(圖6F)。這些結(jié)果表明，circACTN4通過(guò)海綿吸收miR-424-5p調(diào)節(jié)YAP1的表達(dá)。此外，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，在與miR-424-5p模擬物和野生型熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染的HEK-293 T細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低(圖6G)。RIP實(shí)驗(yàn)也顯示，與IgG組相比，argonaute 2組circACTN4和miR-424-5p的富集量增加(圖6H)。這些發(fā)現(xiàn)表明circACTN4在ICC細(xì)胞中充當(dāng)了miR-4245p上調(diào)YAP1的海綿。

7）CircACTN4參與Wnt/Hippo信號(hào)通路

由于FZD7是Wnt信號(hào)通路受體，我們推測(cè)circACTN4可能通過(guò)促進(jìn)FZD7轉(zhuǎn)錄參與了該通路的調(diào)控。β-catenin和p-GSK3b表達(dá)的變化與circACTN4過(guò)表達(dá)或敲低一致(圖7A)。在circACTN4過(guò)表達(dá)的RBE細(xì)胞中，β-catenin的核定位顯著增加，而在circACTN4下調(diào)的FRH0201細(xì)胞中，β-catenin的核定位顯著降低(圖7B)。TOP/FOP-Flash報(bào)告分析也顯示，Wnt/β-catenin通路活性分別隨circACTN4過(guò)表達(dá)或敲除而顯著增加或降低(圖7C)。我們進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光檢測(cè)了circACTN4對(duì)β-catenin和YAP1蛋白細(xì)胞定位的影響(圖7D)。結(jié)果顯示，YAP1和β-catenin在過(guò)表達(dá)circACTN4的RBE細(xì)胞中共定位，而circACTN4促進(jìn)了它們的核積累。共免疫沉淀進(jìn)一步證實(shí)了YAP1與β-catenin的相互作用增強(qiáng)(圖7E)。這些結(jié)果表明，circACTN4增強(qiáng)了YAP1與β-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促進(jìn)了它們?cè)贗CC中的激活。

結(jié)論：CircACTN4在ICC中上調(diào)，通過(guò)作為miR-424-5p的分子海綿，以及與YBX1相互作用轉(zhuǎn)錄激活FZD7，促進(jìn)ICC增殖和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明circACTN4是ICC潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Chen Q, Wang H, Li Z, Li F, Liang L, Zou Y, Shen H, Li J, Xia Y, Cheng Z, Yang T, Wang K, Shen F. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2021 Sep 9:S0168-8278(21)02025-0. doi: 10.1016/j.jhep.2021.08.027. Epub ahead of print. PMID: 34509526.